林小華 葉惠嫻 徐巧鈺 許贊杉

(廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系1，廈門 361023)(廈門市中藥生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，廈門 361023)

韭菜子是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材之一，為百合科蔥屬植物韭菜的干燥成熟種子，具有溫補(bǔ)肝腎、壯陽固精的功效，主要用于治療肝腎虧虛、腰膝酸痛、陽痿遺精、遺尿尿頻、白濁帶下等多種病癥[1]。大量藥理研究表明韭菜子具有：改善性功能的作用、治療遺尿的作用、增強(qiáng)免疫的作用以及治療呃逆的作用等[2-6]。少量研究報(bào)導(dǎo)了韭菜子煙熏能治療牙痛的作用、韭菜子油具有抗高溫和抗低溫的作用以及韭菜子水提取物具有耐缺氧和抗疲勞作用[7-9]。目前對(duì)韭菜子油的提取研究主要采用水蒸氣蒸餾法[10]。與傳統(tǒng)的方法比較，超臨界 CO2萃取具有萃取率高、產(chǎn)品純度好、流程簡(jiǎn)單、能耗低、無溶劑殘留，可減少萃取過程中不飽和脂肪酸的氧化，適合不穩(wěn)定、易氧化的揮發(fā)性、脂溶性成分提取分離。本研究采用超臨界CO2萃取技術(shù)提取韭菜子油，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，借助實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件 Design-Expert(V12)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)影響韭菜子油萃取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，建立超臨界CO2萃取韭菜子油的數(shù)學(xué)模型，并采用GC-MS對(duì)韭菜子油的成分進(jìn)行分析，以期為韭菜子油的充分利用和開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

韭菜子：置于60 ℃烘箱中干燥后，粉碎并過40目篩備用；CO2氣體：純度>99.99%；乙醇：分析純。

1.2 儀器

PU-2086-CO2型超臨界萃取儀，Agilent7890B-7000B型氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀，RT-04型多功能粉碎機(jī)，BS224S型精密分析天平，DHG-9055A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 韭菜子油超臨界CO2提取工藝流程

韭菜子→烘干→粉碎→過篩(40目)→稱重→超臨界CO2萃取→分離→韭菜子油

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別以萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間為變量，以韭菜子油提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定各影響因素的適宜范圍。1)萃取壓力對(duì)韭菜子油提取率的影響：選取萃取溫度40 ℃，分別在15、20、25、30、35 MPa萃取2.0 h，考察壓力對(duì)韭菜子油提取率的影響。2)萃取溫度對(duì)韭菜子油提取率的影響：選取萃取壓力25 MPa，分別在35、40、45、50、55、60 ℃萃取2.0 h，考察溫度對(duì)韭菜子油提取率的影響。3)萃取時(shí)間對(duì)韭菜子油提取率的影響：在萃取壓力25 MPa，萃取溫度55 ℃條件下，分別萃取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，考察萃取時(shí)間對(duì)韭菜子油提取率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取萃取壓力、萃取溫度、萃取時(shí)間作為考察變量，以韭菜子油提取率為響應(yīng)值，采用三因素三水平響應(yīng)面分析法進(jìn)行響應(yīng)面分析，對(duì)韭菜子油萃取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.4 甲酯化處理[11]

取韭菜子油0.5 g，置于10 mL具塞試管中，加入正己烷2 mL，0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液1 mL，搖勻，置70 ℃水浴中振搖10 min，冷卻，加水至10 mL，振搖提取，離心，取上清液加無水硫酸鈉脫水，進(jìn)樣分析。

1.3.5 氣相-質(zhì)譜分析條件

色譜條件：HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度：250 ℃，程序升溫：初始溫度70 ℃,保持1 min,以5 ℃/min升溫至180 ℃,保持10 min,以1 ℃/min升溫至250 ℃,保持10 min；進(jìn)樣量：1 μL，分流進(jìn)樣，分流比20:1；載氣為He，載氣流速1.0 mL/min。

質(zhì)譜條件:EI離子源，電子能量70 eV,離子源溫度230 ℃,質(zhì)量掃描范圍50～500 amu。

1.3.6 定性定量分析

采用NIST14.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索和人工譜圖解析相結(jié)合的手段進(jìn)行定性，并用氣相色譜峰面積歸一化法定量計(jì)算出各組分的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 韭菜子油超臨界CO2萃取工藝的優(yōu)化

2.1.1 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

由單因素試驗(yàn)可知，超臨界CO2萃取韭菜子油的較優(yōu)壓力范圍為20～30 MPa，溫度范圍為50～60 ℃，提取時(shí)間范圍在1.5～2.5 h。在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對(duì)韭菜子油提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.1.2 回歸方程的建立及顯著性檢驗(yàn)

利用Design Expert 12.0軟件對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到韭菜子油萃取率Y對(duì)萃取溫度A、萃取壓力B、萃取時(shí)間C的二次多項(xiàng)回歸方程為:Y=40.608 88-0.516 75A-1.251 84B-0.248 287C+0.014 1AB+0.002 533AC-0.000 117BC+0.011 437B2+0.000 532C2。

為了檢驗(yàn)回歸方程的可靠性并確定各因素對(duì)韭菜子油萃取率的影響程度，對(duì)回歸方程進(jìn)行了方差分析，結(jié)果見表3。

表3 方差分析

由表3可以得知，回歸方程模型P值小于0.01，說明回歸方程模型高度顯著，失擬項(xiàng)P值為0.962 3，不顯著，表明回歸方程與實(shí)際擬合度較好，可用于韭菜子油超臨界CO2萃取實(shí)驗(yàn)的理論預(yù)測(cè)。由方差分析結(jié)果可知，一次項(xiàng)中影響顯著的因素為萃取溫度(A) 、萃取壓力(B)、萃取時(shí)間(C)，且對(duì)萃取率的影響大小依次為: 萃取溫度(A)>萃取時(shí)間(C)>萃取壓力(B)。二次項(xiàng)中萃取時(shí)間(C)的平方對(duì)萃取率的影響顯著。3個(gè)影響因素之間的互交作用影響不顯著。

2.1.3 提取工藝條件的確定及檢驗(yàn)

運(yùn)用Design Expert 12.0設(shè)計(jì)優(yōu)化得出最佳萃取條件：萃取溫度59.079 ℃、萃取壓力28.252 2 MPa、萃取時(shí)間147.716 min, 考慮到實(shí)際操作的局限性，將萃取條件調(diào)整為：萃取溫度59 ℃、萃取壓力28.3 MPa、萃取時(shí)間148 min。在此條件下進(jìn)行韭菜子油提取的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，3次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值為3.91%，與理論預(yù)測(cè)值基本相符，驗(yàn)證了該模型的準(zhǔn)確、可靠，也表明優(yōu)化的萃取條件切實(shí)可行。

2.2 韭菜子油的成分組成

對(duì)上述最佳工藝條件下萃取得到的韭菜子油進(jìn)行GC-MS分析，得總離子流圖見圖1，利用NIST14.L標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫和人工譜圖解析相結(jié)合的手段，對(duì)揮發(fā)油成分進(jìn)行鑒定，并用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)含量，各成分見表4。

圖1 韭菜子油總離子流圖

由表4可知，共鑒定出16個(gè)成分，包含13個(gè)脂肪酸化合物、1個(gè)脂肪醇類化合物、1個(gè)酰鹵類化合物和1個(gè)萜類化合物。韭菜子油中主要脂肪酸化合物為：亞油酸、油酸、棕櫚酸、15-羥基亞油酸、硬脂酸、二十二碳二烯酸、二十酸、二十二酸、11-二十碳烯酸等，其中不飽和脂肪占總脂肪酸的88%。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2,3,9]，韭菜子水提物或者醇提物具有溫腎助陽、固精作用。本次研究進(jìn)一步驗(yàn)證了韭菜子的活性成分是中等極性的化合物，不存在于超臨界CO2提取的韭菜子油中。此研究結(jié)果對(duì)韭菜子油進(jìn)一步開發(fā)成食用保健油具有重要意義。

表4 韭菜子油的主要成分及相對(duì)含量

3 結(jié)論

通過采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法優(yōu)化了超臨界CO2萃取韭菜子油的工藝，得到最佳工藝條件為：萃取溫度59 ℃、萃取壓力28.3 MPa、萃取時(shí)間148 min，在此條件下，韭菜子油得率為3.91%。

采用GC-MS對(duì)韭菜子油成分進(jìn)行分析，共鑒定出16個(gè)成分，包含13個(gè)脂肪酸化合物、1個(gè)脂肪醇類化合物、1個(gè)酰鹵類化合物和1個(gè)萜類化合物。其成分以脂肪酸化合物占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，主要為：亞油酸、油酸、棕櫚酸、15-羥基亞油酸、硬脂酸、二十二碳二烯酸、二十酸、二十二酸、11-二十碳烯酸等。