許春平，曲利利，杜歡哲，楊華武*

1 鄭州輕工業(yè)大學食品與生物工程學院，鄭州高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科學大道136號 450002；

2 湖南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，長沙市雨花區(qū)勞動中路386號 410007

近年來國內(nèi)有一些學者采用相關性分析、聚類分析等對煙葉成分或煙氣成分與感官指標之間的相關性進行了一些探索[1-2]。劉善名等[3]研究了曬紅煙中致香物質含量與感官評吸質量的相關關系，研究結果表明β-大馬酮、3-羥基-二氫大馬酮等17種致香物質與感官評吸質量有正面效應，異佛爾酮、2-乙基吡啶等5種致香物質對感官評吸質量有負面效應。殷飛[4]采用PLSR等方法建立了清香型卷煙主流煙氣化學成分與感官指標之間的相關性模型，結果表明清香與巨豆三烯酮呈顯著正相關關系，酸香與油酸呈顯著負相關關系，花香與丁烯酸呈顯著正相關關系。采用膜分離加柱層析的方式對云煙凈油進行處理，能有效降低了生產(chǎn)成本，縮短提取分離的時間，減少工藝過程中的能耗，且所得產(chǎn)品純度較高、加工性能較穩(wěn)定[5]。本研究擬通過GC-MS分析云煙凈油有機膜分離組分的香氣成分組成，計算ROAV值確定其關鍵香氣成分，進行感官分析找出煙草關鍵香味成分與感官指標間的關系，為卷煙增香和制備特征煙用香料提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

YC7659云煙凈油（上海祺源香精香料有限公司），無水乙醇（天津市富宇精細化工有限公司），石油醚（天津市津東天正精細化學試劑廠），乙酸乙酯（天津市津東天正精細化學試劑廠），硅膠粉，薄層層析柱用硅膠H60型。

有機膜分離實驗機BONA-GM-22（博納生物），陶瓷膜分離實驗機BONA-GM-18（博納生物），Agilent GC6890-MS5973N型氣相色譜－質譜聯(lián)用儀，（美國安捷倫科技有限公司），EYELAN-2100全自動旋轉蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司），硅膠薄層層析柱H60型（河南省予華儀器有限公司）玻璃柱：直徑5 cm，長度60 cm，SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵（河南省予華儀器有限公司），DLSB-5/10低溫冷卻循環(huán)泵（鄭州凱鵬實驗儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 膜分離

將乙醇稀釋后的云煙凈油過50 nm陶瓷膜去除固形顆粒雜質，然后將50 nm陶瓷膜透過液過100 kDa有機膜，100 kDa有機膜截留液組分記為M1；100 kDa有機膜透過液組分記為M2，50 nm陶瓷膜透過液記為W。對截留液M1、透過液M2兩組分進行柱層析分離。

1.2.2 柱層析分離

（1）樣品預處理。將100 kDa截留液M1、100 kDa透過液M2旋蒸濃縮，稱取5 g的M1和M2的濃縮物，分別加入1.5倍的硅膠粉，混勻，60℃水浴5小時烘干[6-8]。

（2）裝柱。采用硅膠粉干裝法，制備長度45 cm，直徑5 cm的硅膠柱，將上述烘干后的樣品覆蓋于硅膠上部，再將少許的硅膠覆蓋于樣品之上，最后以棉花覆蓋。

（3）洗脫。分段收集洗脫劑及其配比見表1，洗脫液的流速10 mL/min，按表1的比例依次進行洗脫，每組組分均取得4個柱體積，以便收集各段不同組分的樣品，將硅膠柱層析洗脫分離后得到的產(chǎn)物進行旋蒸濃縮。

表1 過柱層析流程表Tab. 1 Flow chart of column chromatography

1.2.3 GC-MS分析

表2 GC-MS分析條件表Tab. 2 GC-MS analysis conditions

1.2.4 關鍵香氣成分的確定

劉登勇等[9]定義的一種通過閾值確定香味貢獻程度的新指標——相對氣味活度值（ROAV），來確定樣品中的揮發(fā)性成分對整體風味的貢獻程度。計算公式如下：

ROAVi≈（Ci/ Cmax×Tmax/ Ti）*100

式中，ROAVi為物質i的相對香氣活性值；Ci為香氣成分的相對百分含量；Ti為香氣成分的香氣閾值；Cmax與Tmax為對樣品總體風味貢獻最大的組分的相對百分含量和氣味閾值；ROAV≥1的香味物質被確定為關鍵香氣成分；0.1≤ROAV≤1的香味物質被認為對總體風味有貢獻的香氣成分[10-11]。

1.2.5 主成分分析

采用主成分分析法在保留大部分原始信息的基礎上，對變量進行降維，篩選出不同組分云煙精油的關鍵香氣物質[12]。

1.2.6 感官分析

將不同洗脫液比例下的流分45℃真空濃縮得到餾分濃縮物（1000 mL濃縮為5 mL左右），將餾分濃縮物按照0.2%的比例用香精注射機添加10 μL到未加香未加料的空白卷煙（湖南中煙提供）中，在溫度（22±2）℃、相對濕度（60±5）%的恒溫恒濕箱中平衡24 h后進行感官評吸，取僅加等量乙醇的空白煙作對照。感官分析小組從清甜香、木香、花香、干草香、辛香5個香韻來定義樣品的感官屬性，感官特征的強度使用0～9的等級進行評分，其中0 =無或不可察覺的強度，9=極高的強度。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

利用多元偏最小二乘法比較關鍵香氣成分與感官指標的關系，建立云煙凈油關鍵香氣成分與感官屬性的PLS模型。

2 結果與分析

2.1 云煙凈油有機膜分離組分的主成分分析

對截留液和透過液組分的揮發(fā)性成分進行主成分分析，得到兩組組分的累計貢獻率分別為100%和87.839%，根據(jù)累計方差貢獻率高于85%的原則，提取截留液和透過液組分中前4個主成分作為數(shù)據(jù)分析的有效成分。

主成分載荷矩陣分析得出截留液的第1主成分中油酸乙酯，癸醛主成分載荷值較大，分別達到0.913和0.903；第2主成分中的二氫獼猴桃內(nèi)酯的載荷值較大，達到0.942；第3主成分中的4-叔丁基苯酚載荷值較大，達到0.909；總體上，第1、2、3主成分對香氣物質的貢獻較大，而第4主成分相對貢獻較小。油酸乙酯、癸醛、二氫獼猴桃內(nèi)酯的載荷值較高，推測這些物質為關鍵香氣成分。

透過液的第1主成分中甲酸辛酯、正辛醛的主成分載荷值較大，分別達到0.944、0.954；第2主成分中壬醛的主成分載荷值最大；第3主成分中巨豆三烯酮的主成分載荷值最大，達到0.929；正辛醇、壬醛、巨豆三烯酮的載荷值較高，推測這些物質為關鍵香氣成分。

2.2 有機膜分離組分的相對含量和ROAV值

GC-MS譜庫檢索采用NIST庫對截留液和透過液組分進行檢索，從檢索結果中挑選正向、反向檢索匹配度均大于99%的致香成分[13]。

截留液共檢測出25種揮發(fā)性成分，主要包括酯類、酸類、醇類；相關研究在分析古井貢酒、梨酒、綠茶和雞蛋干的關鍵香氣組分中，由表3（a）可知，油酸乙酯、癸醛、壬醛、肉豆蔻醛、3,5-二叔丁基-4-羥基芐醇、苯并噻唑的ROAV大于1，確定這6種為關鍵香氣成分。

透過液共檢測出30種揮發(fā)性成分，主要包括酯類、酸類、醇類；ROAV用于評價揮發(fā)性物質對香氣的貢獻，由表3（b）可知，癸醛，甲酸辛酯，正辛醛，壬醛，酞酸二甲酯，巨豆三烯酮的ROAV大于1，這6種應為關鍵香氣成分。

表3 100 kDa有機膜組分的相對含量以及ROAV值[14-17]Tab. 3 Relative content of 100 kDa organic membrane retentate and ROAV value

續(xù)表3

續(xù)表3

與截留液相比，透過液組分中的揮發(fā)性成分種類和含量都較高，部分香味成分僅存在于透過液組分中，截留液中沒有檢出。可能是截留液組分中這些香味成分與某些含量高的香味成分的保留時間相近，色譜峰被高含量香味成分的色譜峰所掩蓋，導致截留液中未檢測出這些物質[18]。

2.3 感官評價

由表4（a）、圖1（a）可得，石油醚-乙酸乙酯配比為2-1的組分中，木香，花香較明顯，在該組分中，3,5-二叔丁基-4-羥基芐醇的ROAV值大于1且相對含量較高是關鍵香氣成分，該組分具有木香，花香；在石油醚-乙酸乙酯配比為10-1的組分中，清甜香較明顯，花香，干草香稍有，苯并噻唑和壬醛的ROAV值均大于1且相對含量較高，該組分具有清甜香，花香，干草香；在石油醚-乙酸乙酯配比為20-1的組分中，清甜香，干草香，木香的香氣較明顯，花香和青香稍有，油酸乙酯，癸醛，壬醛，肉豆蔻醛的ROAV值均大于1，且含量較高，導致該組分具有清甜香，干草香，木香香氣。

圖1 100 kDa有機膜分離組分感官評析雷達圖Fig.1 Radar chart of sensory evaluation of 100 kDa organic membrane separation components

由表4（b）、圖1（b）可得，在石油醚-乙酸乙酯配比為10-1的組分中，青香，干草香稍有，癸醛和巨豆三烯酮的ROAV值均大于1且相對含量較高，為該組的關鍵香氣成分，該組分具有青香，干草香；在石油醚-乙酸乙酯配比為20-1的組分中，清甜香，辛香，木香的香氣較明顯，花香稍有，癸醛、壬醛的ROAV值均大于1且相對含量較高為該組的關鍵香氣成分，該組分具有清甜香，辛香，木香香氣。

表4 100 kDa有機膜組分感官評價表Tab. 4 Sensory evaluation table of 100 kDa organic membrane retentate

2.4 感官評價關鍵香氣成分與感官屬性的PLS分析

以關鍵香氣成分的ROAV值為X變量，以感官屬性評分為Y變量進行相關性分析，建立PLS模型如圖2所示。

圖2（a）顯示苯并噻唑，距清甜香，花香分布較遠，不能作為特征香味物質，主要呈香成分油酸乙酯與干草香、癸醛與青香分布在較近的區(qū)域，說明它們之間相關性較強。且在本組中存在有二氫獼猴桃內(nèi)酯，由于無法查詢其具體的閾值，所以ROAV值為空白，但盧樂華[19]研究表明，二氫獼猴桃內(nèi)酯也是煙葉香氣的特征香氣成分。

圖2（b）顯示主要呈香成分巨豆三烯酮與青香味、壬醛與清甜香、癸醛與辛香分布在較近的區(qū)域，說明它們之間相關性較強。

圖2 云煙凈油100 kDa有機膜分離組分的關鍵香氣成分與感官屬性的PLS相關性載荷圖Fig.2 PLS correlation load diagram of key aroma components and sensory attributes of 100 kDa organic membrane separation components of Virginia tobacco absolute

3 結論

本研究采用GC-MS分析云煙凈油有機膜分離組分中的香氣成分組成，通過建立偏最小二乘回歸分析模型反映出關鍵香氣組分和香韻之間的關聯(lián)性（如油酸乙酯和干草香相關性較強；壬醛和清甜香相關性較強），該結論與主成分中所篩查出的關鍵香氣成分相互印證，所含香韻特征成分及分布與其感官評價結果吻合，為云煙凈油關鍵香氣成分的確定以及關鍵香氣成分與感官指標的關系提供了相關科學依據(jù)。