張 方 張淑艷 高雅琪 孫培勝 劉玉林 （鶴壁職業(yè)技術(shù)學院，鶴壁458030）

乳腺癌是導致全球女性癌癥死亡的主要原因之一，2018 年全球有2 088 849 例新發(fā)乳腺癌病例，占女性死亡人數(shù)的15.0%［1-2］。目前，乳腺癌已被認為是一種異質(zhì)性疾病，根據(jù)雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2 的狀態(tài)，可分為不同的病理亞型［3］。對于晚期乳腺癌患者，當腫瘤切除不可行時，可考慮全身化療［4］。然而，不幸的是全身化療大多是無效的，因為化療的耐藥性。順鉑是一種廣泛應用于晚期乳腺癌治療的化療藥物［5］。然而，高劑量的順鉑會導致嚴重的副作用，也會殺死正常細胞，尤其是那些頻繁再生的細胞。更嚴重的是順鉑的長期副作用，也是致癌的，可以導致繼發(fā)性癌癥［6］。因此，探尋具有潛在治療效果的新療法是必要的。

microRNA（miRNA）是一個大的基因表達轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)家族，其長度約為21 個核苷酸，參與真核生物的發(fā)育和細胞過程［7］。過去十年的研究已經(jīng)確定了參與miRNA生物發(fā)生的主要因素，并確立了miRNA功能的基本原理。miRNA 的代謝和功能通過一系列機制的調(diào)節(jié)，這些機制涉及大量的蛋白-蛋白和蛋白-RNA 的相互作用［8］。這種調(diào)控在 miRNA 的環(huán)境特異性功能中起著重要作用［9］。miRNA與包括癌癥在內(nèi)的許多疾病有關(guān)［10］。miR-598 在某些腫瘤中發(fā)揮相應功能。有報道稱miR-598 通過靶向IGF-1R在人胃癌中發(fā)揮抑癌作用［11］。YANG等［12］揭示miR-598 通過負調(diào)控Derlin-1 和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）抑制非小細胞肺癌（NSCLC）的侵襲和遷移。CHEN等［13］的研究表明 miR-598 通過抑制 JAG1/Notch2 通路刺激EMT 來抑制結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移。還有報道發(fā)現(xiàn)miR-598 的表達通過靶向URI 抑制卵巢癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移［14］。然而，miR-598 在乳腺中的作用鮮有報道。

FGFR2 是受體酪氨酸激酶亞家族的成員，該家族還包括 FGFR1、FGFR3 和 FGFR4［15］。越來越多的證據(jù)表明，F(xiàn)GF-FGFR2 信號通路在乳腺癌中發(fā)揮重要作用。FGFR2 在乳腺癌組織中的基因擴增和過表達也被描述，特別是在三陰性乳腺癌中［16］。因此，使用人類細胞模型的FGFR2 過表達和抑制劑研究支持FGFR2在乳腺癌中的促腫瘤形成功能［17］。

本研究考察miR-598與FGFR2在乳腺癌MCF-7細胞中的關(guān)系，并探討miR-598 對乳腺癌細胞糖代謝和細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本獲取 選取2018年7月至2019年12月在新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院行乳腺癌切除術(shù)的患者21 例，入組患者術(shù)前均未接受放療或者化療，平均年齡（54.8±6.7）歲。非浸潤性癌5 例，浸潤性癌16 例。組織標本包括患者原發(fā)性乳腺癌組織和癌旁組織（距離病灶>5 cm，并有病理證實無腫瘤細胞浸潤），切取后迅速冷凍在液氮中，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑和儀器 乳酸檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；葡萄糖檢測試劑盒購自上海金畔生物科技有限公司；人乳腺癌細胞株MCF-7、MDA-MB-231、HCC1937 和人正常乳腺細胞Hs 578Bst 均購自 Procell 公司；RPMI1640 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)液、青霉素、鏈霉素購自美國Gibco 公司；miR-598 mimic 購自上海生工；pmirGLO 載體、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega 公司；FGFR2 質(zhì)粒購自 RiboBio 公司；Lipofectamine?2000、Superscript RNase H-逆轉(zhuǎn)錄酶、抗體 Bcl-2（1 μg/ml）購自美國 Invitrogen 公司；RNA purifica?tion system 購自德國 Qiagen 公司；DNase-Ⅰ購自瑞士羅氏公司；隨機六聚體購自美國Sigma-Aldrich 公司；SYBR Green Master Mix 購自美國Thermo Fisher公司；JC-1 試劑盒、10% SDS-PAGE、PVDF 膜、ECL化學發(fā)光檢測試劑盒、羊抗兔IgG-HRP 購自北京索萊寶科技有限公司；抗體Bax（1∶1 000）、Caspase-3（1∶1 000）、Caspase-9（1∶1 000）、FGFR2（1∶1 000）、Actin（1∶1 000）購自美國 CST 公司；ABI Prism 7000系統(tǒng)購自美國Applied Biosystems公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人乳腺癌細胞株MCF-7、MDAMB-231、HCC1937和人正常乳腺細胞Hs 578Bst常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 qRT-PCR 總RNA用RNA purification system提取。用DNase-Ⅰ去除基因組DNA。用Superscript RNase H-逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機六聚體從5 mg 總RNA 中制備cDNA。用SYBR Premix Ex Taq RT-PCR 試劑盒和miRNA 引物進行qRT-PCR 反應。檢測基因的引物序列如下：miR-598 正向引物5'-AGCTACGT?CATCGTTGTCATC-3'，反 向 引 物 5'-GTGTCGTC?GAGTCGGCAATTC-3'；FGFR2 正向引物 5'-CGCTG?GTGAGGATAACAACACG-3'，反向引物 5'-TGGAAGTTCATACTCGGAGACCC-3'；β-actin 正向引物 5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，反 向 引 物5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'。每個基因均生成標準曲線，擴增效率為90%～100%。通過閾值比較，確定基因表達的相對定量。所有結(jié)果均以β-actin為基準進行歸一化。

1.2.3 熒光素報告基因?qū)嶒?通過TargetScan 軟件在線預測miR-598 與FGFR2 的靶向關(guān)系。將FG?FR2 的3'UTR 片段（wt 和mut）構(gòu)建到熒光素酶報告載體（pmirGLO）：Luc-FGFR2 3'UTR wt、Luc-FGFR2 3'UTR mut。然后 miR-NC 或 miR-598 mimic 與 pmir?GLO（wt 和 mut）共轉(zhuǎn)染 MCF-7 細胞。熒光素酶活性由雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定。

1.2.4 細胞轉(zhuǎn)染及分組 乳腺癌細胞系MCF-7 在含有5%胎牛血清、50 μg/ml 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2環(huán)境中。48 h 后按照Lipofectamine?2000 操作說明，將 miR-598 mimic 和pcDNA-FGFR2 及其對應的對照（miR-NC、pcDNA）轉(zhuǎn)染進入MCF-7 細胞。細胞分為4 組：對照組（Con?trol）、miR-598 mimic 組、pcDNA-FGFR2 組和 mimic+FGFR2組。

1.2.5 葡萄糖攝取量檢測 4 組細胞培養(yǎng)24 h 后，收集培養(yǎng)液上清，按照葡萄糖檢測試劑盒使用說明進行操作。根據(jù)普通糖標準品繪制的標準曲線，計算出各組培養(yǎng)液上清中葡萄糖含量，各組細胞的葡萄糖攝取量=空白對照組葡萄糖含量-各組培養(yǎng)液中葡萄糖含量。

1.2.6 乳酸生成量檢測 4 組細胞培養(yǎng)24 h 后，收集培養(yǎng)液上清，按照乳酸檢測試劑盒使用說明進行操作。用酶標儀在530 nm 波長處測定樣品吸光度。乳酸生成量計算：乳酸生成量（mmol/L）=3×（OD樣品-OD空白對照）/（OD標準品-OD空白對照）。

1.2.7 克隆形成實驗 將不同組的MCF-7 細胞接種于6孔板中，250個/孔細胞，每3～4 d換液，10～14 d后結(jié)晶紫染色。每個孔用PBS 仔細洗2 次，將菌落在1 ml 甲醇中固定20 min，然后1 ml 結(jié)晶紫染色20 min，細流水沖洗干凈。統(tǒng)計≥50個細胞的克隆數(shù)，計算克隆形成效率，克隆百分比（%）=克隆形成數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.2.8 流式細胞術(shù) 4組MCF-7細胞（1×106個/ml）胰蛋白酶化后在1 ml 培養(yǎng)液中重懸，用10 μg/ml JC-1 在 37℃、5%CO2條件下孵育 30 min。經(jīng) JC-1 染色后，用流式細胞術(shù)分析紅色和綠色發(fā)射熒光。

1.2.9 Western blot 用10%SDS-PAGE 分離細胞和腫瘤中的蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。5%脫脂牛奶阻斷后，蛋白質(zhì)與第一抗體在4℃條件下孵育過夜。主要抗體如下：Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、FGFR2和Actin。PBS洗滌，羊抗兔IgG-HRP孵育1 h。用ECL化學發(fā)光檢測試劑盒觀察條帶。

2 結(jié)果

2.1 miR-598 在乳腺癌組織及細胞系中的表達 通過qRT-PCR 檢測乳腺癌組織及不同乳腺癌細胞系中miR-598 的表達。如圖1A 所示，與癌旁組織比較，乳腺癌組織中miR-598 的表達顯著下調(diào)（P<0.05）。如圖1B所示，與人正常乳腺細胞比較，乳腺癌細胞系 MCF-7、MDA-MB-231 及 HCC1937 中 miR-598的表達也顯著下調(diào)（P<0.05）。

圖1 miR-598在乳腺癌組織及細胞系中的表達水平Fig.1 Relative expressions of miR-598 in breast tissues and cell lines

2.2 miR-598 靶向 FGFR2 基因 如圖 2A 所示，生物信息學軟件預測miR-598靶向FGFR2 3'UTR存在多個堿基結(jié)合位點，位置為552～558，F(xiàn)GFR2 可能是miR-598 的靶基因。為了揭示 miR-598 與 FGFR2 的相互作用，用 miR-598 mimic 與 pcDNA-FGFR2 單獨或聯(lián)合轉(zhuǎn)染至乳腺癌MCF-7 細胞，構(gòu)建過表達體系，qRT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染效率。如圖 2B、C 所示，miR-598和FGFR2 mRNA 相對表達水平較之各自對照組均顯著上調(diào)（P<0.05），表明過表達體系構(gòu)建成功。如圖2D 所示，與對照組比較，miR-598 mimic 組的miR-598 相對表達水平顯著上調(diào)（P<0.05），pcDNA-FGFR2 組顯著下調(diào)（P<0.05）；與 pcDNA-FGFR2 組比較，mimic+FGFR2 組的miR-598 相對表達水平顯著上調(diào)（P<0.05）。如圖2E 所示，與對照組比較，miR-598 mimic 組的FGFR2 mRNA 相對表達水平顯著下調(diào)（P<0.05），pcDNA-FGFR2 組顯著下調(diào)（P<0.05）；與 pcDNA-FGFR2 組比較，mimic+FGFR2 組的FGFR2 mRNA 相對表達水平顯著下調(diào)（P<0.05）。上述結(jié)果表明，miR-598 與 FGFR2 在 MCF-7 細胞中呈負相關(guān)表達。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步驗證了miR-598 和FGFR2 的靶向關(guān)系。如圖2F 所示，在 Luc-FGFR2 3'UTR wt 中，與 miR-NC 組比較，miR-598 組的相對熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）；而在 Luc-FGFR2 3'UTR mut 中，與 miR-NC 組比，miR-598 組的相對熒光素酶活性無顯著變化。由此證實miR-598靶向FGFR2基因。

圖2 miR-598與FGFR2基因的靶向關(guān)系Fig.2 Targeting relationship between miR-598 and FG?FR2 gene

2.3 miR-598 對乳腺癌細胞增殖的影響 克隆形成實驗檢測MCF-7細胞的生長情況。如圖3A所示，與對照組比，miR-598 mimic組的克隆形成率顯著降低（P<0.05），而 pcDNA-FGFR2 組顯著升高（P<0.05）；與 pcDNA-FGFR2 組比，mimic+FGFR2 組的克隆形成率顯著降低（P<0.05）。蛋白印跡實驗檢測增殖相關(guān)蛋白表達，如圖3B 所示，與對照組比，miR-598 mimic 組的 Ki67 和 PCNA 蛋白表達顯著下調(diào)（P<0.05），而 pcDNA-FGFR2 組顯著上調(diào)（P<0.05）；與 pcDNA-FGFR2 組比，mimic+FGFR2 組的Ki67 和 PCNA 蛋白表達顯著下調(diào)（P<0.05）。由此可見，miR-598 可通過靶向 FGFR2 抑制 MCF-7 細胞增殖。

圖3 miR-598通過靶向FGFR2對MCF-7細胞增殖的影響Fig.3 Effects of miR-598 by targeting FGFR2 on prolifer?ation of MCF-7 cells

2.4 miR-598 對乳腺癌細胞線粒體膜電位及凋亡的影響 流式細胞術(shù)檢測MCF-7 細胞線粒體膜電位變化及細胞凋亡。如圖4A 所示，與對照組比較，miR-598 mimic 組的紅綠熒光比例明顯下降，而pcDNA-FGFR2 組的紅綠熒光比例無顯著差異；與pcDNA-FGFR2組比，mimic+FGFR2組的紅綠熒光比例明顯降低。如圖4B 所示，與對照組比較，miR-598 mimic 組的細胞凋亡率顯著升高（P<0.05），而pcDNA-FGFR2組的細胞凋亡率顯著降低（P<0.05）；與 pcDNA-FGFR2 組比，mimic+FGFR2 組的細胞凋亡率顯著升高（P<0.05）。蛋白印跡實驗檢測線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2 及外源性凋亡途徑相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-9，如圖4C所示，與對照組比較，miR-598 mimic 組的 Bax/Bcl-2、cleaved cas3/cas3 和cleaved cas9/cas9 表達比例顯著升高（P<0.05），而pcDNA-FGFR2 組顯著降低（P<0.05）；與 pcDNA-FGFR2 組比較，mimic+FGFR2 組的 Bax/Bcl-2、cleaved cas3/cas3 和 cleaved cas9/cas9 表達比例顯著回升（P<0.05）。由此表明，miR-598 可通過靶向FGFR2 導致MCF-7 細胞線粒體膜去極化，促進細胞凋亡。

圖4 miR-598 通過靶向FGFR2 對MCF-7 細胞線粒體膜電位及凋亡的影響Fig.4 Effects of miR-598 on mitochondrial membrane po?tential and apoptosis of MCF-7 cells by targeting FGFR2

2.5 miR-598 對MCF-7 細胞的葡萄糖攝取量和乳酸生成量的影響 試劑盒檢測MCF-7 細胞的葡萄糖攝取量和乳酸生成量。如圖5A、B 所示，與對照組比較，miR-598 mimic組的葡萄糖攝取量和乳酸生成量顯著降低（P<0.05），而pcDNA-FGFR2 組的葡萄糖攝取量和乳酸生成量顯著升高（P<0.05）；與pcDNA-FGFR2組比較，mimic+FGFR2組的葡萄糖攝取量和乳酸生成量顯著回降（P<0.05）。由此表明，miR-598 可通過靶向FGFR2 抑制MCF-7 細胞的糖代謝。

圖5 miR-598通過靶向FGFR2對MCF-7細胞糖代謝的影響Fig.5 Effects of miR-598 on glucose metabolism in MCF-7 cells by targeting FGFR2

3 討論

近十多年來，對miRNA 在疾病發(fā)展中的作用，特別是在癌癥中的作用研究，使miRNA 成為新治療方法的有力工具和靶點［18］。功能研究證實，miRNA失調(diào)在許多癌癥病例中具有因果關(guān)系，miRNA 可作為腫瘤抑制因子或致癌基因（oncomiRs），而針對miRNA的模擬物和靶向miRNA的分子（anti-miRs）已在臨床前開發(fā)中顯示出希望［19］。正如前面提及的miR-598 在胃癌、NSCLC 和結(jié)直腸癌中異常表達，上調(diào)miR-598有抑制腫瘤的作用。而FGFR2被證實與乳腺癌風險高度相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)miR-598在乳腺癌組織及乳腺癌細胞系中均下調(diào)表達。在MCF-7細胞中miR-598與FGFR2的表達呈負相關(guān)。進一步證實FGFR2為miR-598的靶基因。

已有報道顯示，成纖維細胞生長因子受體2（FGFR2）導致酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域通過與成纖維細胞生長因子（FGFs）結(jié)合及二聚體化啟動細胞內(nèi)信號的級聯(lián)反應，后者參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［20］。HUANG 等［21］報道，F(xiàn)GFR2 通過 PI3K-Akt-Mtor 途徑抑制血小板反應蛋白4的表達，促進細胞增殖，從而促進胃癌進展。CHANG 等［22］研究揭示 FGF9/FG?FR2 通過激活小鼠間質(zhì)瘤細胞中的ERK1/2、Rb/E2F1 和細胞周期通路來增加細胞增殖。YANG等［23］結(jié)果表明，miR-381 通過直接靶向 FGFR2 抑制口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖。在本研究中，F(xiàn)GFR2同樣促進乳腺癌細胞增殖，阻礙線粒體膜電位去極化，抑制凋亡。而miR-598 逆轉(zhuǎn)了FGFR2 的效應。miR-598 過表達能抑制細胞增殖，促進線粒體膜電位去極化，從而導致細胞凋亡。腫瘤細胞將葡萄糖作為獲取ATP 的主要來源，進行能量代謝，其中糖酵解為其主要方式。由于腫瘤增殖迅速，其長期處于缺氧環(huán)境下，而糖酵解可在缺氧條件下正常進行。糖代謝異常是腫瘤細胞的一個重要特性［24］。在本研究中，miR-598抑制FGFR2表達，進而減少葡萄糖攝入量和乳酸生成量。

綜上所述，miR-598通過靶向FGFR2基因，阻礙其表達，從而抑制乳腺癌細胞增殖和糖代謝，并且促進細胞凋亡。