李婷娜 韓一栩 韋秋圓 王曉暖 周小飛 （海口市婦幼保健院婦產(chǎn)科，?？?70311）

宮頸癌是女性生殖道最常見的惡性腫瘤之一，在女性惡性腫瘤中的發(fā)病率和死亡率排名第四，在全世界生殖道惡性腫瘤中排名第一［1］。盡管醫(yī)療技術(shù)在不斷地進步，宮頸癌治療手段取得了一定的療效，但是宮頸癌患者的長期生存率仍然較差，并且放化療存在嚴重的副作用［2］。分子靶向治療是治療宮頸癌最有前景的新型治療方法，其治療關(guān)鍵是尋找分子靶點［3］。研究報道在宮頸癌發(fā)生過程中存在某些癌基因和抑癌基因的異常表達，在宮頸癌的惡性進展中發(fā)揮重要作用，具有成為抗腫瘤治療靶標的潛力［4］。免疫球蛋白超家族成員細胞黏附分子2（cell adhesion molecule 2，CADM2）在體內(nèi)能量穩(wěn)態(tài)的維持過程中發(fā)揮重要作用［5］。最近的研究表明CADM2 可以作為腫瘤抑制因子，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腎透明細胞癌和食管鱗狀細胞癌等多種腫瘤組織中低表達或者表達缺乏，抑制腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等多種惡性生物學行為，可能是抗腫瘤治療的潛在分子靶點［6-8］。但是CADM2 在宮頸癌中發(fā)揮的功能及作用機制鮮有報道。本文旨在研究CADM2 的異常表達在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用，為CADM2 作為宮頸癌治療潛在分子靶標提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 Trizol 試劑購自美國Invitrogen 公司；RNA 提取試劑盒、SYBR Green Mastermix 試劑盒和蛋白裂解液購自北京索萊寶公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉(zhuǎn)錄購自美國Thermo公司；CADM2 和GAPDH 引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；宮頸癌細胞HeLa、SiHa、C33A 和正常宮頸上皮鱗狀細胞H8 購自上海中國科學院；FBS和胰酶購自美國Hyclone 公司；細胞培養(yǎng)基購自北京清大天一生物技術(shù)有限公司；過表達CADM2 慢病毒購自上海吉凱基因有限公司；CCK8 試劑購自美國GlpBio 公司；細胞周期檢測試劑盒和BCA 檢測試劑盒購自上海碧云天試劑有限公司；Transwell 小室購自美國corning公司；PVDF膜購自邁博瑞生物膜技術(shù)有限公司；兔多克隆CADM2（ab64873）、兔多克隆cyclin D1（ab16663）、兔多克隆CDK4（ab108357）和MMP2（ab92536）抗體購自英國Abcam 公司；ECL化學發(fā)光試劑盒購自上?；鄯f生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 宮頸癌細胞HeLa、SiHa、C33A和正常宮頸上皮鱗狀細胞H8 立即復蘇后重懸至FBS 濃度為10%的細胞培養(yǎng)基中，放置在37℃、5%CO2的全濕度培養(yǎng)箱中生長。細胞培養(yǎng)基顏色變化時，棄掉培養(yǎng)基，PBS 洗滌1 次，進行細胞換液。細胞長滿時，棄掉培養(yǎng)基，PBS 洗滌1 次，胰酶消化進行細胞傳代。

1.2.2 qRT-PCR 宮頸癌細胞經(jīng)PBS 洗滌1 次，之后將PBS 吸除，加入Trizol 試劑裂解細胞，采用RNA提取試劑盒提取細胞裂解液中的細胞總RNA。采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。并以cDNA 為模板，加入CADM2上下游引物，采用SYBR Green Mas?termix 試劑盒獲得檢測樣品的循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct），按照 2-ΔΔCt公式以 GAPDH 為內(nèi)參計算CADM2 mRNA 的相對表達量。CADM2 引物序列F：5′-AAACTTCCAAGGCATATCTCACC-3′，R：5′-TGCGATTTGCATCCTCTTCTT-3′。GAPDH引物序列F：5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，R：5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′。

1.2.3 細胞感染 宮頸癌細胞呈對數(shù)生長時，采用胰酶收集細胞，血球計數(shù)板進行計數(shù)。以1×105個/孔細胞接種至6 孔板中，分為LV 組和OE-CADM2 組。放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h 后進行各組病毒的感染，將無關(guān)序列與病毒感染增強液混勻后加至LV 組細胞培養(yǎng)液中，過表達CADM2 慢病毒與病毒感染增強液混勻后加至OE-CADM2 組細胞培養(yǎng)液中，12 h 棄掉病毒液，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)96 h 后進行后續(xù)實驗。

1.2.4 CCK8 實驗 胰酶消化收集LV 組和OECADM2 組宮頸癌細胞，血球計數(shù)板進行計數(shù)。以1 500 個/孔細胞接種至96 孔板中，每組設(shè)置6 個復孔，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細胞接種的第0 h、24 h、48 h、72 h和96 h時，分別在每個樣品孔中加入10 μl CCK8 試劑，放置培養(yǎng)箱中孵育1 h。采用酶標儀檢測每個樣品孔在450 nm處的吸光度值（OD值）。

1.2.5 流式細胞實驗 胰酶消化收集LV 組和OECADM2組宮頸癌細胞，PBS洗滌2次，血球計數(shù)板進行計數(shù)。每管5×105個細胞，每組設(shè)置3 個復孔，加入預冷的無水乙醇進行細胞固定12 h。PBS 洗滌2 次后，加入細胞周期染色緩沖液和PI 染色液，37℃孵育15 min，流式上機進行細胞周期的檢測。

1.2.6 Transwell 實驗 胰酶消化收集LV 組和OECADM2 組宮頸癌細胞，無血清培養(yǎng)基洗滌2 次，血球計數(shù)板進行計數(shù)。以1×105個/孔細胞接種至24 孔板中 Transwell 小室的上室中，24 孔板中 Tran?swell 小室的下室中，加入含有 10%FBS 的 500 μl 細胞培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h 左右，PBS將Transwell 小室上未穿過的細胞洗去后，甲醇固定穿過的細胞，蘇木素染色。顯微鏡下拍照，計數(shù)穿膜細胞的個數(shù)。

1.2.7 Western blot 檢測蛋白表達 胰酶消化收集LV 組和 OE-CADM2 組宮頸癌細胞，PBS 洗滌 1 次，加入蛋白裂解液裂解細胞，高速低溫離心30 min 提取細胞中的總蛋白。BCA 試劑盒檢測細胞蛋白濃度后，加入上樣緩沖液后沸水煮5 min。SDS-PAGE凝膠電泳分離變性后的蛋白，電泳后的蛋白經(jīng)濕轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。PVDF膜依次與5%BSA常溫孵育1 h、目的一抗稀釋液（CADM2、cyclin D1、CDK4 和MMP2抗體稀釋比均為1∶1 000）4℃孵育過夜、兔二抗稀釋液（1∶10 000）室溫孵育1 h。TBST 洗滌3 次后，采用ECL試劑盒顯示蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均以表示，獨立樣本t檢驗比較兩組間的統(tǒng)計學差異，方差分析比較兩組以上的統(tǒng)計學差異。P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CADM2 在宮頸癌組織中的表達水平 采用TCGA 數(shù)據(jù)庫（http：//ualcan. path. uab. edu/index.html）分析CADM2 在宮頸癌組織中的表達水平，結(jié)果顯示CADM2 mRNA 在305 例宮頸癌組織中的表達水平顯著低于其在3例正常宮頸組織中的表達水平（P<0.05，圖1）。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫分析CADM2在宮頸癌組織中的表達情況Fig.1 Expression of CADM2 in cervical cancer tissues was analyzed by TCGA database

2.2 CADM2在宮頸癌細胞系中的表達水平 采用qRT-PCR 檢測 CADM2 在人宮頸癌細胞系 HeLa、Si?Ha、C33A 和正常宮頸上皮鱗狀細胞H8 中的表達水平，結(jié)果顯示CADM2 在宮頸癌細胞系HeLa、SiHa、C33A 中的相對表達量分別為 1.07±0.09、1.45±0.06、0.76±0.08，在正常宮頸上皮鱗狀細胞 H8 中的相對表達量為2.11±0.03。CADM2 在宮頸癌細胞中的表達均顯著低于在正常宮頸上皮鱗狀細胞H8 中的表達，其中在C33A 細胞中的表達最低（F=230.301，P<0.05，圖2）。

圖2 qRT-PCR分析CADM2在宮頸癌細胞系中的表達水平Fig.2 Expression level of CADM2 in cervical cancer cell lines was analyzed by qRT-PCR

2.3 CADM2過表達慢病毒感染效果 選擇CADM2表達較低的宮頸癌細胞系C33A 感染CADM2 過表達慢病毒，采用qRT-PCR 檢測CADM2 過表達效果，結(jié)果顯示LV 組C33A 細胞中CADM2 相對表達量為1.00±0.09，OE-CADM2 組 C33A 細胞中 CADM2 相對表達量為 9.74±1.45。OE-CADM2 組中 CADM2相對表達量顯著高于LV組（t=10.40，P<0.05，圖3）。

圖3 qRT-PCR 驗證CADM2過表達慢病毒感染效果Fig.3 qRT-PCR to verify effect of CADM2 overexpres?sion lentivirus infection

2.4 CCK8 檢測細胞增殖能力 采用CCK8 實驗檢測CADM2 對宮頸癌細胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示，與 LV 組 C33A 細胞相比，OE-CADM2 組 C33A 細胞增殖能力顯著降低，P<0.05，且隨著時間的推移，兩組的細胞增殖能力差異越顯著，見圖4。

圖4 CCK8 檢測CADM2 對宮頸癌細胞C33A 增殖能力的影響Fig.4 Effect of CADM2 on proliferation ability of cervical cancer cells C33A was detected by CCK8

2.5 流式細胞儀檢測細胞周期 采用流式細胞儀檢測CADM2 對宮頸癌細胞周期的影響，結(jié)果顯示，與 LV 組 C33A 細胞相比，OE-CADM2 組 C33A 細胞G0/G1期細胞比率顯著增加（P<0.05，圖5）。

圖5 流式細胞儀實驗檢測CADM2 對宮頸癌細胞C33A周期的影響Fig.5 Effect of CADM2 on cervical cancer cell C33A cy?cle was detected by flow cytometer

2.6 Transwell 實驗檢測細胞轉(zhuǎn)移能力 采用Tran?swell 實驗檢測CADM2 對宮頸癌細胞轉(zhuǎn)移的影響，結(jié)果顯示，LV 組C33A 細胞穿膜細胞數(shù)為（256.67±23.42）個，OE-CADM2組細胞穿膜細胞數(shù)為（89.33±16.98）個。OE-CADM2 組細胞 C33A 轉(zhuǎn)移能力顯著低于LV組C33A細胞（t=13.95，P<0.001，圖6）。

圖6 Transwell實驗檢測CADM2對宮頸癌細胞C33A轉(zhuǎn)移能力的影響（×200）Fig.6 Effect of CADM2 on metastatic ability of cervical cancer cells C33A was detected by Transwell test（×200）

2.7 Western blot 實驗檢測CADM2 對細胞周期蛋白和轉(zhuǎn)移蛋白表達的影響 采用Western blot 實驗檢測CADM2對宮頸癌細胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1、CDK4和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP2表達的影響，結(jié)果顯示與 LV 組 C33A 細 胞 相 比 ，OE-CADM2 組 細 胞 中CADM2 蛋白表達增加，cyclin D1、CDK4 和 MMP2 蛋白的表達降低，見圖7。

圖7 Western blot 檢測 CADM2 對宮頸癌細胞 C33A 細胞周期蛋白和轉(zhuǎn)移蛋白表達的影響。Fig.7 Effect of CADM2 on expression of cyclin and trans?fer protein in cervical cancer cell C33A was detect?ed by Western blot

3 討論

宮頸癌是全世界最常見的婦科腫瘤，人類乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）的持續(xù)感染在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，盡管由于HPV 疫苗的廣泛使用和診斷技術(shù)的發(fā)展，宮頸癌的發(fā)病率逐漸降低。但是在包括中國在內(nèi)的發(fā)展中國家宮頸癌患者的人數(shù)每年都在增加，同時患者的年齡呈年輕化趨勢，嚴重威脅著中國婦女的生命健康和安全［9］。目前根治性手術(shù)、補充放療或放療聯(lián)合順鉑化療是宮頸癌治療的主要方法。然而由于晚期宮頸癌的最重要特征是局部浸潤、遠處轉(zhuǎn)移和復發(fā)率較高，這些患者對目前治療手段的臨床反應欠佳，導致患者預后較差［2］。宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展像一個網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)一樣復雜，其潛在機制仍然未知，因此在分子水平研究宮頸癌的發(fā)病機制是探索有效治療策略的重要方法。

CADM2（也稱為 SynCAM2、Igsf4d 和 Nectin 樣分子3）位于3號染色體上，在多個正常組織中表達，在整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)中富集，并通過其細胞外結(jié)構(gòu)域形成寡聚體，已經(jīng)建立了CADM2 及包括CADM1 等相關(guān)家族成員，共同參與大腦神經(jīng)元中突觸前特化的組裝，以指導新生和成熟突觸裂之間的同源和異源相互作用［10］。研究表明敲除CADM2 的轉(zhuǎn)基因小鼠的全身葡萄糖水平、肥胖程度均顯著降低，而對胰島素敏感性、運動能力和能量消耗率均顯著增加［5］。表明CADM2 密切參與神經(jīng)系統(tǒng)和能量代謝等正常生理過程［5，10］。CADM2主要表達在大腦組織中，研究報道其在腦組織中表達異常引起神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生，與正常腦組織相比，CADM2 在人腦膠質(zhì)瘤組織中顯著下調(diào)，并且在高級別膠質(zhì)瘤組織中CADM2 表達水平顯著降低。CADM2 過表達在體外和體內(nèi)均抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力［6］。CADM2 腎透明細胞癌中表達下調(diào)，且CADM2 的異位表達抵消了miR-146a 對腎透明細胞癌細胞增殖、遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的促進作用［7］。而 DAI 等［11］報道在非小細胞肺癌中CADM2通過調(diào)控E-鈣黏蛋白促進患者的腦轉(zhuǎn)移，表明CADM2 的生物學功能較為復雜，可能發(fā)揮癌基因或者抑癌基因的功能。但CADM2 在宮頸癌中的作用未知，TCGA 數(shù)據(jù)庫是分析腫瘤生物信息學最重要的公共基因表達來源數(shù)據(jù)庫［12］。目前TCGA 發(fā)布了305 例診斷為宮頸癌患者的基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組概況的綜合分析。本文采用TCGA 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)CADM2 在宮頸癌組織中的表達水平顯著低于在正常宮頸組織中的表達，提示CADM2 在宮頸癌中可能同樣發(fā)揮抑癌作用。

為了研究CADM2 在宮頸癌中發(fā)揮的具體作用，本文首先采用qRT-PCR 檢測CADM2 在宮頸癌細胞系和正常宮頸上皮鱗狀細胞中的表達，結(jié)果顯示CADM2 在宮頸癌細胞系中表達下調(diào)，與TCGA 數(shù)據(jù)庫分析CADM2 在宮頸癌組織中表達的結(jié)果一致。研究報道在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腎透明細胞癌和食管鱗狀細胞癌中CADM2 與腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力相關(guān)［6-8］。本文采用慢病毒感染技術(shù)對CADM2 表達較低的宮頸癌細胞C33A 進行外源性CADM2 的表達，功能實驗顯示過表達CADM2 抑制宮頸癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移能力。細胞周期不受調(diào)控是導致腫瘤惡性增殖的重要作用機制，抑制細胞周期進展是抗腫瘤治療的重要途徑，流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)過表達CADM2 導致宮頸癌細胞周期阻滯在G0/G1 期［13］。與 LIU 等［6］在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的研究一致。在腎癌細胞和肝細胞肝癌細胞中CADM2 通過阻斷AKT 信號通路調(diào)控腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，CADM2 在宮頸癌中發(fā)揮作用的分子機制仍需進一步研究［14-15］。生理過程中細胞周期受到嚴格的調(diào)控，主要包括細胞周期蛋白和周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）的調(diào)控，其中cyclin D1和CDK4 形成復合物后，促進細胞由G0/G1 期進入S 期，進而促進細胞周期的進展［16］。本文采用 West?ern blot 實驗檢測發(fā)現(xiàn)CADM2 過表達抑制宮頸癌細胞中cyclin D1 和CDK4 蛋白的表達。MMP 家族通過降解細胞外基質(zhì)，促進腫瘤細胞發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，MMP2 是MMP 家族的一種重要蛋白酶，在宮頸癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用［17］。本文采用Western blot實驗檢測發(fā)現(xiàn)CADM2 過表達抑制宮頸癌細胞中MMP2 蛋白的表達。表明CADM2 通過調(diào)控細胞周期相關(guān)蛋白和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白抑制宮頸癌的惡性進展。

綜上所述，CADM2抑制宮頸癌的增殖和轉(zhuǎn)移能力，在宮頸癌中可能通過調(diào)控細胞周期相關(guān)蛋白和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白發(fā)揮抑癌作用。CADM2 是宮頸癌治療的潛在分子靶點。