左靈妮 劉 康 馬曉勤 楊雅麗 （甘肅省慶陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院肛腸科，慶陽(yáng)745000）

腸道黏膜屏障是腸道的第一道防線，不僅可以將腸道細(xì)菌與外界隔離開，還可調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)吸收和黏膜免疫平衡［1］。腸上皮是一層單層的柱狀細(xì)胞，位于腸黏膜腔表面，腸上皮細(xì)胞的完整性是腸道黏膜屏障的重要組成部分［2-3］。在某些慢性疾病的發(fā)展過程中，腸道菌群受到外部因素（例如細(xì)菌感染）刺激時(shí)發(fā)生紊亂，導(dǎo)致黏膜屏障受到破壞，最終引起全身性炎癥以及代謝和腸道疾?。?］。因此，維持正常的腸道黏膜屏障對(duì)人類健康和生存至關(guān)重要。脂多糖（LPS）是一種內(nèi)毒素，也是一種強(qiáng)促炎癥分子，作為革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的主要成分，LPS主要由保守的脂質(zhì)A和多糖組成［4］。目前，LPS已被證明是影響腸道黏膜屏障功能的關(guān)鍵因素。

天然產(chǎn)物及其衍生物越來(lái)越多地用于抵抗人類疾病。茶黃素（theaflavins，TF）是在綠茶發(fā)酵成紅茶過程中兒茶素類的酶催化氧化二聚作用形成的特征性多酚。近年來(lái)，由于茶黃素顯示出各種生理作用，如抗氧化劑、抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎、抗病毒、抗牙周炎以及預(yù)防骨質(zhì)疏松的效果，已引起越來(lái)越多的關(guān)注［5］。研究表明，茶黃素對(duì)高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用［6］。在大鼠的氣道上皮細(xì)胞培養(yǎng)中，茶黃素可減少炎癥細(xì)胞因子釋放［7］。茶黃素對(duì)大鼠缺血性腦損傷有一定的預(yù)防作用［8］。長(zhǎng)度為19～35 個(gè)核苷酸的微小RNA（miRNA）已被證實(shí)參與腸上皮細(xì)胞損傷過程［9］。miR-190 在LPS 誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞損傷中下調(diào)表達(dá)，過表達(dá) miR-190 抑制 LPS 誘導(dǎo)的 BV2 細(xì)胞損傷［10］。miR-190 在過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)可抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，減少乳酸脫氫酶（lactate de?hydrofenase，LDH）釋放和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量［11］。但茶黃素對(duì) LPS 誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮炎癥損傷的影響，以及這一過程是否涉及miR-190 的機(jī)制尚不清楚。在本研究中，假設(shè)茶黃素可以抵抗LPS 誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞損傷。為了驗(yàn)證這一推測(cè)，本研究以人結(jié)腸上皮細(xì)胞株NCM460 為研究對(duì)象，結(jié)合miR-190，探討茶黃素是否可以改善LPS 誘導(dǎo)的炎癥狀態(tài)和凋亡變化。

1 材料與方法

1.1 材料 茶黃素（含量≥98%，成都普菲德生物公司）；人結(jié)腸上皮細(xì)胞株NCM460（美國(guó)模式菌種收集中心 ATCC）；LPS（美國(guó) Sigma 公司）；miR-190 mimic/inhibitor 及各自陰性對(duì)照miR-NC、anti-miRNC（上海 Genepharma 公司）；Lipofectamine 2000、TRIzol 試劑、SuperScript First Strand cDNA 系統(tǒng)（美國(guó)Invitrogen 公司）；SYBR Green PCR 試劑盒（中國(guó)上海Qiagen公司）；IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物公司）；抗B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）抗體、抗Bcl-2相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體、抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG二抗（美國(guó)Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460 在含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，常規(guī)傳代。

1.2.2 細(xì)胞分組與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460 分為以下幾組：Con 組（對(duì)照組，未給予藥物處理）、LPS組（給予1 mg/L LPS作用24 h［12］）、LPS+TF-L 組（給予 16 μmo/l L 茶黃素［6］和1 mg/L LPS作用24 h），LPS+TF-M組（給予32 μmo/l L茶黃素和1 mg/L LPS 作用24 h），LPS+TF-H 組（給予64 μmo/l L茶黃素和1 mg/L LPS作用24 h）、LPS+miR-NC 組（轉(zhuǎn)染miR-NC 24 h 后，給予1 mg/L LPS作用 24 h），LPS+miR-190 組（轉(zhuǎn)染 miR-190 mimic 24 h 后，給予 1 mg/L LPS 作用 24 h）、LPS+TF+antimiR-NC組（轉(zhuǎn)染anti-miR-NC 24 h后，給予64 μmo/l L茶黃素和1 mg/L LPS 作用24 h），LPS+TF+anti-miR-190組（轉(zhuǎn)染miR-190 inhibitor 24 h后，給予64 μmo/l L茶黃素和1 mg/L LPS 作用24 h）。轉(zhuǎn)染前1 d，細(xì)胞以1×105個(gè)/ml接種于6孔板，生長(zhǎng)到70%～80%匯合時(shí)，根據(jù)制造商的方案，使用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，保持6 h。然后用RPMI1640 培養(yǎng)基代替轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，并在37℃下再保持24 h。

1.2.3 ELISA 檢測(cè) IL-6、IL-1β 和 TNF-α 表達(dá) 收集各組NCM460 細(xì)胞上清液，分別遵循IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA 試劑盒說明書操作步驟，測(cè)定炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α表達(dá)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞凋亡 通過膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙重染色法測(cè)定結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460 的凋亡率。收獲不同處理的NCM460 細(xì)胞，收集 5×105個(gè)細(xì)胞，將其懸浮于500 μl 結(jié)合緩沖液 Binding Buffer 中，并依次加入 5 μl Annexin VFITC 和PI。在黑暗中孵育15 min 后，通過FACS Calibur流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。

1.2.5 Western blot 分析Bcl-2和Bax 蛋白表達(dá) 將結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460在RIPA 裂解緩沖液中裂解，提取總蛋白。在10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）中分離40 μg 蛋白，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。將印跡用5%脫脂牛奶封閉1 h，并與Bcl-2、Bax、GAPDH 一抗在4℃ 孵育過夜。然后將膜用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG 二抗在室溫下再孵育2 h。蛋白條帶通過ECL Plus 檢測(cè)系統(tǒng)可視化。使用Image J 軟件進(jìn)行圖像定量，以GAPDH為對(duì)照，分析Bcl-2蛋白和Bax蛋白的表達(dá)。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）測(cè)定miR-190 表達(dá) 經(jīng)過不同處理后，收集細(xì)胞，TRIzol 試劑提取總RNA。根據(jù)說明書，使用SuperScript First Strand cDNA 系統(tǒng)將 2 μg 總 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。將該cDNA 用作模板并進(jìn)行定量PCR。采用SYBR Green PCR 試劑盒在ABI PRISM 7700系統(tǒng)上進(jìn)行定量分析。用 2-ΔΔCt法計(jì)算 miR-190 表達(dá)，U6 用作內(nèi)部對(duì) 照 。 miR-190 和 U6 引 物 序 列 參 照 SUN 等［13］的報(bào)道。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS22.0軟件分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)信息。所有數(shù)據(jù)均顯示為。兩組間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間的比較采用單因素方差分析，組間多重比較使用SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 茶黃素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響 圖1 結(jié)果顯示，與Con 組比較，LPS 組結(jié)腸上皮細(xì)胞 NCM460 中炎癥因子 IL-6、IL-1β 和TNF-α表達(dá)水平顯著升高；與LPS組比較，LPS+TF-L組、LPS+TF-M 組和LPS+TF-H 組明顯降低結(jié)腸上皮細(xì)胞 NCM460 中炎癥因子 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 的表達(dá)水平，且隨茶黃素濃度的增加，3 種炎癥因子的表達(dá)逐漸降低（P<0.05）。

圖1 茶黃素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響Fig.1 Effect of theaflavins to LPS-induced colon epithelial inflammatory factor expression

2.2 茶黃素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡的影響 圖2 結(jié)果顯示，與Con 組比較，LPS 組結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460 的凋亡率明顯增加，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平明顯降低，Bax 蛋白表達(dá)水平明顯升高；與LPS 組比較，LPS+TF-L 組、LPS+TF-M 組和 LPS+TF-H 組結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460 的凋亡率明顯減少，提高Bcl-2蛋白表達(dá)水平，降低Bax蛋白表達(dá)水平，且隨茶黃素濃度的增加，細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)逐漸降低，Bcl-2蛋白表達(dá)漸漸升高（P<0.05）。

圖2 茶黃素對(duì)LPS誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of theaflavins on apoptosis of colonic epithelial cells induced by LPS

2.3 茶黃素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞中miR-190表達(dá)的影響 圖3結(jié)果顯示，與Con組比較，LPS組結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460 中miR-190 表達(dá)水平顯著降低；與 LPS 組比較，LPS+TF-L 組、LPS+TF-M 組和LPS+TF-H 組明顯提高結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460 中miR-190 的表達(dá)水平，且隨茶黃素濃度的增加，miR-190的表達(dá)逐漸增強(qiáng)（P<0.05）。

圖3 茶黃素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞中miR-190 表達(dá)的影響Fig.3 Effects of theaflavins on expression of miR-190 in colonic epithelial cells induced by LPS

2.4 miR-190 過表達(dá)對(duì)LPS 誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響 圖4 結(jié)果表明，與LPS+miRNC 組比較，LPS+miR-190 組結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460內(nèi)miR-190 表達(dá)量明顯增加，炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）。

圖4 miR-190過表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響Fig.4 Effect of miR-190 overexpression on expression of colonic epithelial inflammatory factors induced by LPS

2.5 miR-190 過表達(dá)對(duì)LPS 誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡的影響 圖5 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與LPS+miR-NC 組比較，LPS+miR-190 組結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460 的細(xì)胞凋亡率明顯減少，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高，Bax蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）。

圖5 miR-190過表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effect of miR-190 overexpression on apoptosis of colonic epithelial cells induced by LPS

2.6 抑制miR-190 表達(dá)逆轉(zhuǎn)了茶黃素（64 μmol/L）對(duì)LPS 誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞炎癥損傷的作用 圖6結(jié)果顯示，與LPS+TF+anti-miR-NC 組比較，LPS+TF+anti-miR-190 組明顯降低結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460中 miR-190 表達(dá)，顯著提高炎癥因子 IL-6、IL-1β、TNF-α 的表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率，并明顯降低Bcl-2蛋白表達(dá)水平，顯著提高Bax蛋白表達(dá)水平（P<0.05）。

圖6 抑制miR-190 表達(dá)逆轉(zhuǎn)了茶黃素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞炎癥損傷的作用Fig.6 Inhibition of miR-190 expression reversed effect of theaflavins on LPS induced inflammatory injury of colonic epithelial cells

3 討論

LPS 是強(qiáng)大的細(xì)菌致病因子，當(dāng)腸道環(huán)境紊亂時(shí)，LPS 可通過脫落或細(xì)菌裂解從細(xì)菌細(xì)胞壁釋放出來(lái)，并作為腸道炎癥反應(yīng)的有效激活劑，影響腸道上皮細(xì)胞功能［13］。為了治療腸道疾病并減輕患者的痛苦，研究人員正在尋找抗LPS 的有效天然產(chǎn)物。茶黃素是紅茶中存在的主要活性多酚，包括茶黃素-3-沒食子酸酯、茶黃素-3′-沒食子酸酯和茶黃素-3-3′-沒食子酸酯，具有顯著的抗炎效果［14-15］。因此，本研究試圖探討茶黃素對(duì)LPS 感染過程中結(jié)腸上皮細(xì)胞的保護(hù)作用和分子機(jī)制。

當(dāng)前的研究通過評(píng)估與炎癥和凋亡狀態(tài)有關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)，探討了茶黃素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。既往研究表明，LPS 會(huì)誘導(dǎo)促炎癥細(xì)胞因子表達(dá)并最終引起炎癥［16］。TNF-α是一種細(xì)胞信號(hào)蛋白（細(xì)胞因子），可誘導(dǎo)凋亡性細(xì)胞死亡和炎癥，TNF-α表達(dá)失調(diào)與多種疾病有關(guān)，主要在腸道中引起炎癥性腸?。?］。IL-1β、IL-6 是與炎癥相關(guān)的關(guān)鍵介質(zhì)。資料顯示，茶黃素給藥減少了LPS 處理的小鼠中 TNF-α 和 IL-1β 含量，并抑制經(jīng)LPS 處理的人小膠質(zhì)細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子TNF-α 的產(chǎn)生，從而抑制活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)毒性作用［17］。茶黃素可減少大鼠結(jié)扎誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性牙周炎中IL-6 的分泌［18］。與這些研究一致，本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示，LPS 處理24 h 后顯著提高了結(jié)腸上皮細(xì)胞炎癥因子 IL-6、IL-1β、TNF-α 表達(dá)。而細(xì)胞給予16 μmo/l L、32 μmo/l L、64 μmo/l L 的茶黃素處理后，LPS 誘導(dǎo)的促炎因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的表達(dá)被抑制，且這種抑制作用隨茶黃素作用濃度的增加而逐漸提高。這些結(jié)果表明，茶黃素在對(duì)抗LPS誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)方面具有良好的潛力。

大量研究已證實(shí)，LPS 可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬［19-21］。凋亡是程序性細(xì)胞死亡的一種形式，對(duì)正常細(xì)胞存活十分重要。凋亡是一個(gè)活躍的過程，涉及許多基因的激活、表達(dá)和調(diào)控［22］。Bcl-2 和Bax 屬于Bcl-2 基因家族，在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用。Bcl-2成員位于線粒體中，具有促凋亡功能（Bax）或抗凋亡功能（Bcl-2）［23］。先前的研究表明，LPS 誘導(dǎo)的組織損傷（如腸道損傷）伴隨著凋亡細(xì)胞的增加［24］。茶黃素處理下調(diào)了胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1 中乙醇損傷誘導(dǎo)的Bax 和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）表達(dá)水平，上調(diào)Bcl-2 表達(dá)水平，可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡來(lái)保護(hù)GES-1細(xì)胞免于乙醇損傷［25］。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，LPS刺激24 h可顯著增加細(xì)胞凋亡率。LPS顯著上調(diào)結(jié)腸上皮細(xì)胞中Bax 蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2 蛋白表達(dá)，而茶黃素則抵消了這些LPS誘導(dǎo)的效果。提示茶黃素通過抑制促凋亡蛋白Bax 表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)而減弱LPS 誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡，與前人報(bào)道相符［23］。為了探索茶黃素對(duì)抗LPS的潛在機(jī)制，本研究觀察到不同濃度的茶黃素可以促進(jìn)miR-190 表達(dá)，且促進(jìn)作用隨茶黃素濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。提示茶黃素對(duì)LPS損傷的結(jié)腸上皮細(xì)胞的治療作用與其調(diào)節(jié)miR-190基因的能力有關(guān)。

同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LPS 可下調(diào)miR-190 表達(dá)。在不同癌癥中，miR-190 的作用已得到廣泛探討［26-28］。最近的研究表明，miR-190 影響心臟缺血/再灌注和帕金森?。?0-11］。目前尚未建立miR-190 與非癌性結(jié)腸疾病之間的關(guān)系。因此，這項(xiàng)研究應(yīng)用了不同的miR-190 質(zhì)粒來(lái)幫助理解miR-190 在LPS誘導(dǎo)的炎癥和凋亡損傷中的作用。據(jù)報(bào)道，在LPS誘導(dǎo)的 BV2 細(xì)胞中，miR-190 下調(diào)；當(dāng) miR-190 過表達(dá)時(shí)，LPS 誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞中促炎介質(zhì)（如iNOS、IL-6、TNF-α 和TGF-β1）的表達(dá)受到抑制，抗炎性介質(zhì)（如IL-10）增加，且miR-190 的上調(diào)抑制了LPS 誘導(dǎo)的BV2 細(xì)胞凋亡［10］。這一結(jié)果與本項(xiàng)研究結(jié)果相符，一方面，miR-190 過表達(dá)可抑制LPS 誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α 的表達(dá)，另一方面，miR-190 過表達(dá)降低LPS 誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)，并顯著提高Bcl-2 蛋白表達(dá)水平。這表明miR-190 過表達(dá)可減輕LPS 誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡，從而發(fā)揮一定的保護(hù)作用。此外，抑制miR-190表達(dá)后，茶黃素抑制LPS 誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞中 IL-6、IL-1β、TNF-α 表達(dá)、細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)的作用，以及促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)的作用被逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果說明，茶黃素保護(hù)結(jié)腸上皮細(xì)胞免受LPS 損傷的功能機(jī)制與調(diào)控miR-190有關(guān)。

總之，本研究的結(jié)果強(qiáng)調(diào)了茶黃素是改善結(jié)腸上皮細(xì)胞損傷的有效天然產(chǎn)物。由于其顯著的抗炎和抗凋亡能力，茶黃素有效地保護(hù)結(jié)腸上皮細(xì)胞免受LPS 誘導(dǎo)的傷害。并且，茶黃素的功能是通過調(diào)控細(xì)胞中miR-190的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。以上結(jié)果表明，茶黃素可能是預(yù)防與LPS 相關(guān)的腸道疾病的有效治療劑。