趙麗 陳昕

順鉑（cisplatin，DDP）作為化療藥物因其價格低廉且效果突出而在各種惡性腫瘤的治療中廣泛應(yīng)用，然而順鉑的臨床應(yīng)用受到耐藥和不良反應(yīng)的限制。順鉑治療期間或治療后不久可出現(xiàn)相關(guān)的心臟不良事件，包括心律失常、心室肥大、心肌炎和心絞痛[1-2]，但其誘導(dǎo)的心臟損傷的機(jī)制仍不明確，而氧化應(yīng)激被認(rèn)為是其損傷主要的機(jī)制之一。因此作為臨床廣泛應(yīng)用的化療藥物之一，減輕順鉑誘導(dǎo)的心臟損傷意義重大[3-4]。核轉(zhuǎn)錄因子2（nuclear transcription factor 2，Nrf2）是調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激的核心轉(zhuǎn)錄因子，能發(fā)揮強大的抗氧化/抗凋亡作用。當(dāng)細(xì)胞或機(jī)體暴露于活性氧（reactive oxygen species，ROS）時，ROS 可引起細(xì)胞骨架相關(guān)性抑制蛋白Keap-1 的磷酸化，從而使Keap-1-Nrf2 復(fù)合體解離，使Nrf2 由胞質(zhì)移位到胞核內(nèi)，與受其調(diào)控的抗氧化酶基因的抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，使抗氧化蛋白水平增加。有研究顯示Nrf2 可以抵抗ROS 引起的心臟損傷[5-7]，而Nrf2 可能與順鉑誘導(dǎo)的心臟損傷相關(guān)[8-9]。

曲美他嗪（trimetazidine，TMZ）是一種代謝調(diào)節(jié)劑，常用于抗心絞痛的治療，通過抑制3-酮酰輔酶A硫酶降低脂肪酸氧化，并增強心肌葡萄糖氧化[10-11]。研究顯示CSE/H2S 通路通過抑制凋亡和氧化應(yīng)激介導(dǎo)曲美他嗪對H9C2 心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用[12]。有研究發(fā)現(xiàn)TMZ 可以減輕順鉑誘導(dǎo)的腎損傷、肝損傷[13-14]，目前還未有TMZ 減輕順鉑心臟損傷的報道。為進(jìn)一步探索TMZ 在Nrf2/ARE 信號通路中對心肌細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，本研究擬檢測 Keap-1、Nrf2 和抗氧化酶類靶蛋白如血紅素氧合酶 1（hemo oxygenase 1，HO-1）的表達(dá)水平，揭示其減輕順鉑不良反應(yīng)和保護(hù)心臟作用的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

順鉑和TMZ 購自美國MCE 公司?？贵w及引物購自美國Abcam 公司，包括Keap-1、Nrf2、H0-1 抗體和二抗；引物序列為Nrf2-rFGCACATCCAGACA GACACCAN，Nrf2-rRGGCTGGGAATATCCAGGG CA，HO-1-rFCACTGCTGACAGAGGAACACA，HO-1-rRGCATAAATTCCCACTGCCACG 及Keap-1-rFA ACCCCATGACCAACCAGTG，Keap-1-rRCACTCG TCTCGATCTGGCTC。Counting Kit-8（CCK8）購自美國Sigma-Aldrich 公司。GAPDH 抗體購自華安生物公司。ChemiDocTMXRS+成像系統(tǒng)來自美國Bio-Rad 公司。Novex?ECL 化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific 公司。ROS 試劑盒購自南京建城公司。Sprague Dawley（SD）大鼠購自北京生命河實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠心肌細(xì)胞的分離和細(xì)胞活力檢測 新生2d 的Sprague Dawley（SD）大鼠麻醉后切下心臟并分離心室，用Hanks 溶液洗滌3 次，并切成小碎片。通過胰蛋白酶消化、離心后取細(xì)胞懸浮液在培養(yǎng)基接種后收集未附著的心肌細(xì)胞，接種到96 孔培養(yǎng)板中分組：對照組，200 μM 順鉑治療（順鉑組），200 μMTMZ預(yù)處理（順鉑+TMZ 組），在用TMZ 預(yù)處理2 h 及在200 μM 順鉑處理24 h 后使用Counting Kit-8（CCK8）測量細(xì)胞活力。使用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）讀取器在450 nm 處測量每個孔的光密度。

1.2.2 ROS 水平檢測 將細(xì)胞與50 μM DCFH-DA探針37 ℃孵育30 min。使用熒光微板讀取器分別在488 nm 和525 nm 的激發(fā)和發(fā)射波長下測量熒光強度。使用試劑盒測量細(xì)胞中ROS 的含量。

1.2.3 Western blot 檢測 Keap-1、Nrf2 及HO-1 蛋白的表達(dá)提取蛋白，計算上樣量。配制10%分離膠，5%濃縮膠，并進(jìn)行跑膠。轉(zhuǎn)膜：取出膠板，剪合適大小的硝酸纖維素膜放入甲醇中激活1 min，按照黑板-黑色泡沫-濾紙-膠-硝酸纖維素膜-濾紙-黑色泡沫-白板順序300 mA，60 min 轉(zhuǎn)膜。封閉：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出硝酸纖維素膜用鉛筆標(biāo)記marker，放入封閉液中，搖床60 min。一抗：封膜加一抗，4 ℃過夜。洗膜：TBST 3 次，TBS 1 次，10 min/次。二抗：封膜加2 抗，室溫?fù)u床1.5 h。封膜避光加顯色劑，上機(jī)器跑6 min。Image J 軟件對信號強度進(jìn)行量化。

1.2.4 Real-time PCR 檢測 Keap-1、Nrf2 及HO-1 的表達(dá) 提取RNA：取材后將組織加入一定量的Trizol 進(jìn)行超聲，加入1/5 Trizol 量的氯仿，震蕩20 s后室溫靜置5 min，12 000×g 離心15 min，將上層液體吸入新的EP 管中，加入1/2 Trizol 量的氯仿，震蕩20 s后，室溫靜置10 min，12 000×g 離心10 min，棄掉上清后，加入等Trizol 量的75%乙醇進(jìn)行洗脫，7 500×g 離心5 min，棄掉上清后，室溫晾干，加入適量DEPC 水，56 ℃金屬浴孵育10 min。逆轉(zhuǎn)錄：測量樣本的濃度，計算所需RNA 的量。設(shè)置10 μL 體系：5×buffer 2 μL，dNTP 0.5 μL，M-MLVRT 0.5 μL，去離 子 水1 μL，Random Primer1 μL，RNA+H2O 5 μL。上機(jī)程序：70 ℃10 min，4 ℃ 5 min，30 ℃10 min，42 ℃ 1 h，70 ℃ 15 min，4 ℃保存。Real-time PCR：設(shè)置10 μL，Mix5 μL，目的引物1 μL，cDNA4 μL，內(nèi)參選用18S。程序：94 ℃10 min，（94 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s）×40 個循環(huán)，94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，65～95 ℃，每增加1 ℃采集一次熒光，95 ℃ 1 min。根據(jù)Ct 值計算表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

Image J 軟件對Western blot 結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，余所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 6 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗結(jié)果以x±s 的形式表示。多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TMZ 顯著減弱順鉑對心肌細(xì)胞活力的抑制作用

如圖1 所示，與對照相比，經(jīng)順鉑處理24 h 后心肌細(xì)胞活力顯著降低（P<0.0001），TMZ 預(yù)處理明顯減弱順鉑對細(xì)胞活力的抑制作用（P<0.01）。

圖1 順鉑對大鼠心肌細(xì)胞活力的毒性作用以及TMZ 的保護(hù)作用

2.2 TMZ 有效抑制ROS 的活性

如圖2 所示，與對照相比，順鉑顯著促進(jìn)ROS（P<0.000 1）的聚集，與順鉑處理的細(xì)胞相比，使用TMZ預(yù)處理能有效地抑制ROS（P<0.01）的活性。

圖2 順鉑對大鼠心肌細(xì)胞氧化作用以及TMZ 的抗氧化保護(hù)作用

2.3 TMZ 明顯減低Nrf2 和Keap-1 的蛋白表達(dá)，增強HO-1 蛋白的表達(dá)

如圖3 所示，為Nrf2、Keap-1 和HO-1 蛋白的表達(dá)情況。如表1 所示，與對照組相比，順鉑處理的Nrf2 表達(dá)顯著增加（P<0.001），TMZ 明顯促進(jìn)了Nrf2 的核易位（P<0.01）。順鉑促進(jìn)了Keap-1（P<0.01）和HO-1 的表達(dá)（P<0.01），TMZ 進(jìn)行預(yù)處理可抑制Keap-1 的表達(dá)（P<0.01），增強HO-1 的表達(dá)水平（P<0.01）。

圖3 Keap-1、Nrf2 和HO-1 蛋白的表達(dá)

表1 TMZ 明顯減低Keap-1 和Nrf2 蛋白的表達(dá)，增強HO-1的表達(dá)

2.4 TMZ 顯著抑制了Keap-1 的表達(dá)，促進(jìn)了Nrf2核易位，顯著增強了HO-1 的表達(dá)

如表2 所示，順鉑顯著促進(jìn)Keap-1（P<0.0001）和HO-1 的表達(dá)（P<0.0001）。與順鉑處理的細(xì)胞相比，用TMZ 進(jìn)行預(yù)處理，明顯抑制了Keap-1 的表達(dá)（P<0.000 1），增強了HO-1 的表達(dá)水平（P<0.001）。與對照組相比，順鉑處理的Nrf2 表達(dá)顯著增加（P<0.0001）。與單獨使用順鉑治療相比，TMZ 預(yù)處理顯著促進(jìn)了Nrf2 的核移位（P<0.01）。

表2 TMZ 通過抑制Keap-1 調(diào)控Nrf2 及HO-1 的表達(dá)

3 討論

順鉑導(dǎo)致心臟不良事件已有報道，本研究也發(fā)現(xiàn)順鉑顯著抑制了大鼠心肌細(xì)胞的活力，而TMZ（200 μM）可顯著改善順鉑對心肌細(xì)胞活力的抑制，證明TMZ對順鉑誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷具有保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激是順鉑誘導(dǎo)的心臟損傷的主要機(jī)制之一。氧化物質(zhì)ROS 大量產(chǎn)生會導(dǎo)致抗氧化防御能力的破壞或消耗[15-16]，同時過量的ROS 也可引起膜脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生MDA 等毒性物質(zhì)[17-18]，直接導(dǎo)致心臟損傷[19]。有研究表明，TMZ 可抑制氧化應(yīng)激[20]，可減輕ROS 觸發(fā)的線粒體功能障礙[21]，改善順鉑誘導(dǎo)的腎損傷和肝損傷[13-14]。本實驗結(jié)果也表明，代謝調(diào)節(jié)劑TMZ 對順鉑誘導(dǎo)的心臟損傷具有顯著的調(diào)控作用，細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平受到明顯的抑制，表明TMZ 對順鉑所誘導(dǎo)的心臟損傷的改善作用與其提高抗氧化酶的活性而起到清除自由基的作用有關(guān)。Nrf2 是抗氧化防御系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，正常情況下，Nrf2 與Keap-1結(jié)合穩(wěn)定地存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞或機(jī)體受到損傷時，Keap-1 磷酸化使 Nrf2 從Nrf2-Keap-1 復(fù)合體中解離而移位到胞核內(nèi)，與其調(diào)控的HO-1、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）和醌氧化還原酶 1（NQO1）結(jié)合而上調(diào)下游抗氧化酶的表達(dá)，抵抗ROS 的毒性作用。有研究發(fā)現(xiàn)，激活Keap-1/Nrf2/HO-1 信號通路可抑制氧化應(yīng)激[22-23]。本研究的數(shù)據(jù)也表明，TMZ 預(yù)處理可以顯著降低Keap-1 的表達(dá)，胞漿中的Nrf2 從Keap-1 解離并移位到核內(nèi)，上調(diào)了下游HO-1 的表達(dá)，抑制了ROS 的產(chǎn)生，表明TMZ 具有顯著的抗氧化應(yīng)激作用。

此外，Dixon 等[24]2012年在研究纖維肉瘤的抗腫瘤藥物時發(fā)現(xiàn)化合物erastin 能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生一種以線粒體皺縮、雙層膜密度增加為形態(tài)學(xué)特征，以鐵依賴的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)為代謝特征，且受胱氨酸轉(zhuǎn)運通路調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡方式，并將其命名為鐵死亡(ferroptosis)。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)鐵死亡在細(xì)胞代謝、氧化還原、退行性疾病、癌癥等方面發(fā)揮重要作用[25]。有研究發(fā)現(xiàn)P62/Keap-1/Nrf2 信號通路抑制了鐵死亡，在氧化應(yīng)激導(dǎo)致的鐵死亡中起到重要作用[26]。谷胱甘肽過氧化酶 4（glutathione peroxidase 4, GPX4）廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體及膜上，具有降低脂質(zhì)體過氧化反應(yīng)、修復(fù)膜脂質(zhì)的氧化損傷的功能[27]，是調(diào)控鐵死亡且也是調(diào)控ROS 的重要調(diào)控因子[28-29]，而Nrf2/ARE 通路的激活有助于HNC 細(xì)胞抵抗GPX4抑制，而抑制該通路則逆轉(zhuǎn)了HNC 對鐵死亡的抵抗[30]，表明了Nrf2/ARE 通路與鐵死亡的密切關(guān)系。

綜上所述，本研究表明了TMZ 能顯著抑制順鉑引起的心臟損傷，這部分依賴于Keap-1/Nrf2/HO-1 相關(guān)的抗氧化防御系統(tǒng)，而Keap-1/Nrf2/HO-1 抗氧化通路可能與鐵死亡關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白GPX4 存在關(guān)聯(lián)，提示曲美他嗪的抗氧化作用也可能與鐵死亡通路相關(guān)，可作為抗氧化劑用于化療藥物引起的心臟損傷的治療，也為研究曲美他嗪的心臟保護(hù)機(jī)制提供了新思路。

4 小結(jié)

已發(fā)現(xiàn)和證實化療藥物具有心臟損傷作用，其致?lián)p傷作用的途徑包括氧化應(yīng)激等。本實驗中代謝藥曲美他嗪可以減輕順鉑誘導(dǎo)的心肌損傷，改善心肌細(xì)胞的活力，并減輕ROS 的蓄積，具有抗氧化作用。在抗氧化通路Keap-1/Nrf2/HO-1 中可增加抗氧化反應(yīng)元件HO-1 的表達(dá)水平，證明了曲美他嗪具有明確的抗氧化作用，可減輕順鉑誘導(dǎo)的心臟損傷，也為腫瘤患者的綜合治療提供依據(jù)。