張森林，孫旭東，呂久利

(博愛新開源醫(yī)療科技集團(tuán)股份有限公司 研發(fā)中心，河南 焦作 454450)

聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是一種廣泛使用的水溶性高分子材料，自從被德國(guó)化學(xué)家Reppe發(fā)明以來，逐漸在醫(yī)藥、化妝品、食品、釀造、黏結(jié)、環(huán)保、電池、聚合物合成等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1-6]。PVP按照相對(duì)分子質(zhì)量大小可以分為K17、K30、K60、K85、K90等多種產(chǎn)品，其相對(duì)分子質(zhì)量大小及其分布對(duì)其應(yīng)用性能有重要影響，工業(yè)上常采用的黏度法只能測(cè)得黏均相對(duì)分子質(zhì)量Mv，得不到相對(duì)分子質(zhì)量分布的信息，而且操作步驟繁瑣、誤差較大。其他測(cè)量相對(duì)分子質(zhì)量的方法如滲透壓法、光散射法、超速離心等方法只能得到單獨(dú)的相對(duì)分子質(zhì)量信息而不能獲得相對(duì)分子質(zhì)量分布的信息。

凝膠滲透色譜法(GPC)，是簡(jiǎn)便測(cè)得多種相對(duì)分子質(zhì)量及其分布的有效方法。目前有機(jī)體系的GPC分析已經(jīng)非常成熟，特別是Benoit普適校正方法建立之后，該方法已經(jīng)成為表征高聚物相對(duì)分子質(zhì)量及其分子結(jié)構(gòu)的一種強(qiáng)有力的手段[7]。因?yàn)镻VP在多種有機(jī)溶劑中具有良好的溶解性，國(guó)內(nèi)外研究者多采用有機(jī)溶劑為流動(dòng)相配合添加一定量的鹽類物質(zhì)來改善PVP與色譜柱之間的相互作用，最終測(cè)得的相對(duì)分子質(zhì)量誤差較大[8-10]。而采用水作為流動(dòng)相進(jìn)行GPC分析往往存在非體積排除效應(yīng)，因而采用水溶性GPC測(cè)試PVP相對(duì)分子質(zhì)量的研究很少見諸報(bào)道[11-15]。

本文采用水溶性GPC設(shè)備，以兩根Shodex Ohpak SB-806M HQ(固定相為羥甲基丙烯酸酯凝膠)串聯(lián)作為色譜柱組，考察了流動(dòng)相對(duì)非體積效應(yīng)的影響，利用聚氧乙烯(PEO)/聚乙烯醇(PEO)標(biāo)樣結(jié)合普適矯正方法實(shí)現(xiàn)了高相對(duì)分子質(zhì)量PVP在水溶性GPC上的相對(duì)分子質(zhì)量分析，對(duì)分析方法的重復(fù)性進(jìn)行了驗(yàn)證，所得的方法有良好的參考價(jià)值，有利于在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行推廣。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

PEO/PEG標(biāo)準(zhǔn)品，峰頂(Mp)相對(duì)分子質(zhì)量分別為1 370 000、610 000、260 700、104 700、37 100、12 500、4 300、600，Mw/Mn=1.05～1.10，上海子起生物科技有限公司；K17、K30、K60、K85、K90，博愛新開源醫(yī)療科技集團(tuán)股份有限公司；BASF K85，德國(guó)巴斯夫化學(xué)品公司；超純水由Millipore超純水離子交換器制得；甲醇，色譜純，德國(guó)Merck公司；硝酸鈉，分析純，阿拉丁試劑公司；無水磷酸二氫鉀，分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；無水磷酸氫二鈉，分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

Ultimate 3000凝膠色譜色譜系統(tǒng)：DGP-3600SD泵，WPS-3000(RS)自動(dòng)進(jìn)樣器，TCC-3x00(RS)柱溫箱，ERC RefractoMax520 RI檢測(cè)器，變色龍7.2.9色譜工作站，美國(guó)Thermo Fisher公司；千譜HW2000色譜工作站，上海峰譜軟件有限公司；Shodex OHpak SB-806M HQ凝膠色譜柱(8×300 mm，粒徑13 μm，孔徑1.5×103nm)，SB-G保護(hù)柱(6×50 mm，粒徑10 μm)，日本Shodex公司。

1.2 方法

1.2.1色譜條件

兩根Shodex OHpak SB-806M HQ串聯(lián)，柱前加SB-G保護(hù)柱；流動(dòng)相，0～0.3 mol/L LiNO3的水/甲醇溶液，甲醇∶水=(0～1)∶1(體積比)，或者pH值分別為3.49、6.78、7.54、7.97的0.1 mol/L 磷酸二氫鉀/磷酸氫二甲緩沖鹽水溶液；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣體積10～100 μL，柱溫25 ℃；RI檢測(cè)器溫度40 ℃。

1.2.2樣品分析

稱取0.002 0 g PEO/PEG系列標(biāo)準(zhǔn)品溶于2 mL樣品瓶中，靜置過夜后，輕輕搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進(jìn)樣測(cè)試。PVP樣品采用同樣方法配制后進(jìn)樣測(cè)試。采用變色龍7.2.9軟件記錄色譜圖，采用千譜HW2000工作站計(jì)算相對(duì)分子質(zhì)量及其分布。

1.2.3普適校正方法[8]

為了盡量減小標(biāo)樣分子形態(tài)和樣品之間的差異帶來的誤差，通常采用流體力學(xué)體積為基礎(chǔ)進(jìn)行普適校正，根據(jù)Einstein黏度關(guān)系式1，聚合物的流體力學(xué)體積僅與特性黏度和相對(duì)分子質(zhì)量有關(guān)。

[η]=2.5NV′/M

(1)

其中，[η]為特性黏度；V′表示聚合物鏈等效流體力學(xué)體積；N為阿伏伽德羅常數(shù)；M為聚合物相對(duì)分子質(zhì)量。

根據(jù)Benoit提出并證明的普適校正原理，在一個(gè)很寬的聚合物結(jié)構(gòu)范圍內(nèi)，所有聚合物的淋洗體積對(duì)lg[η]M落在了同一條曲線上，當(dāng)樣品與標(biāo)樣有相同的淋洗體積時(shí)，有以下方程：

[η]1M1=[η]2M2

(2)

其中，下標(biāo)1為標(biāo)樣參數(shù)，下標(biāo)2為樣品參數(shù)。

將Mark-Houwink方程：

[η]=KMα

(3)

帶入(2)式，可以推導(dǎo)出：

(4)

因此，只需要知道標(biāo)樣和樣品在流動(dòng)相中的Mark-Houwink參數(shù)K和α，即可計(jì)算得到樣品的相對(duì)分子質(zhì)量。Mark-Houwink參數(shù)K和α是與溶劑、溫度有關(guān)的常數(shù)。在本實(shí)驗(yàn)中，以0.1 mol/L LiNO3/甲醇=1∶1(體積比)為流動(dòng)相(pH值= 6.79)，以PEO/PEG標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)校正曲線

其線性擬合公式為：

lgM=13.459 9-0.525 1Ve

(5)

其中：Ve為保留時(shí)間，相關(guān)系數(shù)為0.994 9。查閱文獻(xiàn)得到，在該體系下PVP的Mark-Houwink參數(shù)KPVP=1×10-4，αPVP=0.7；標(biāo)準(zhǔn)品PEO/PEG的KPEO=2.21×10-4，αPEO=0.75[15]。αPVP和αPEO都大于0.65，這說明該流動(dòng)相體系對(duì)于標(biāo)樣和待測(cè)樣都是良溶劑，符合普適校正方法的使用條件[7,16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相對(duì)非體積排除效應(yīng)的影響

2.1.1離子強(qiáng)度

實(shí)驗(yàn)所用色譜柱的固定相為羥甲基丙烯酸酯凝膠，單純使用水作為流動(dòng)相時(shí)很容易發(fā)生PVP和固定相之間的吸附作用，導(dǎo)致峰形雜亂、分裂，沒有規(guī)律。因此，以水作為流動(dòng)相，添加不同質(zhì)量的LiNO3配置不同離子強(qiáng)度的流動(dòng)相，對(duì)比了K90、K85、K60、K30、K17的保留時(shí)間和離子強(qiáng)度的關(guān)系。結(jié)果如圖2所示。

離子強(qiáng)度為0時(shí)，峰型雜亂且沒有重復(fù)性，無法確定保留時(shí)間，因此未在圖2中列出。

在離子強(qiáng)度<0.1 mol/L時(shí)，PVP的保留時(shí)間隨離子強(qiáng)度變化明顯，而離子強(qiáng)度>0.1 mol/L時(shí)，PVP的保留時(shí)間隨離子強(qiáng)度變化不大。這說明，在離子強(qiáng)度<0.1 mol/L時(shí)，加入的離子能夠在一定程度上抑制樣品和固定相之間的吸附作用，但是還不能夠完全消除吸附作用，當(dāng)離子強(qiáng)度>0.1 mol/L后，保留時(shí)間隨離子強(qiáng)度變化不大，說明這時(shí)樣品在流動(dòng)相中的形態(tài)基本穩(wěn)定。從圖2中還可以看到，相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)較低的K17、K30和K60的保留時(shí)間隨離子強(qiáng)度增加基本不變，而相對(duì)分子質(zhì)量較高的K85、K90保留時(shí)間隨離子強(qiáng)度增加變化明顯，這說明高相對(duì)分子質(zhì)量的PVP更容易被色譜柱固定相吸附。過高的離子強(qiáng)度可能影響固定相的穩(wěn)定性，所以實(shí)驗(yàn)選取離子強(qiáng)度為0.1 mol/L進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)中還采用LiBr、NaSO4、NaN3以及磷酸緩沖鹽溶液進(jìn)行了類似的研究。結(jié)果表明，這幾種鹽對(duì)PVP的峰型和分離效果都有明顯的改善作用，其作用效果幾乎完全相同，從保護(hù)色譜柱和安全角度考慮，選擇了LiNO3作為添加劑。

圖2 流動(dòng)相離子強(qiáng)度對(duì)樣品保留時(shí)間的影響

2.1.2pH值

以磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配置離子強(qiáng)度為0.1 mol/L，pH值為3.49、6.78、7.54、7.97的磷酸鹽緩沖溶液作為流動(dòng)相，考察不同pH值時(shí)PVP樣品的分離情況如圖3所示。

圖3 pH值對(duì)PVP樣品保留時(shí)間的影響

由圖3可以看出，隨著pH值的下降，不同相對(duì)分子質(zhì)量PVP樣品的分離程度逐漸增大，pH值為3.49時(shí)，樣品間的分離程度最大。相對(duì)分子質(zhì)量較低的K17和K30的保留時(shí)間和峰型隨pH值變化不明顯，而K60、K85和K90保留時(shí)間隨流動(dòng)相pH值變化很大，尤其在流動(dòng)相pH值由7.79降低至6.78的過程中，保留時(shí)間變化非常大，而pH值進(jìn)一步從6.78降低至3.49時(shí)，保留時(shí)間變化相對(duì)較小。這說明在堿性的流動(dòng)相環(huán)境中，高相對(duì)分子質(zhì)量的PVP更容易被色譜柱吸附，而在中性和酸性條件下吸附現(xiàn)象明顯改善，考慮到色譜柱凝膠的耐受性，最終選擇在pH值=6.78的中性條件下進(jìn)行測(cè)試。

2.1.3疏水作用

PVP是一種親水性聚合物，但由于其分子結(jié)構(gòu)中含有的長(zhǎng)碳鏈而具有一定的疏水性，而且相對(duì)分子質(zhì)量越大這種疏水性表現(xiàn)的更加顯著。實(shí)驗(yàn)中配制了LiNO3濃度0.1 mol/L，甲醇∶水體積比分別為0、3∶7、1∶1的流動(dòng)相研究疏水作用對(duì)PVP在色譜柱中分離效果的影響，見圖4。

圖4 流動(dòng)相中甲醇含量對(duì)PVP分離效果的影響

由圖4可以看到，當(dāng)流動(dòng)相中沒有甲醇時(shí)，不同相對(duì)分子質(zhì)量的組分保留時(shí)間非常集中，而甲醇含量增加到30%和50%時(shí)，各組分得到比較有效的分離。從峰形上可以看到，在不加甲醇時(shí)，K30、K60、K90的峰型嚴(yán)重不對(duì)稱，出現(xiàn)了嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象。而加入甲醇之后明顯改善了PVP的分離效果，使得色譜峰更加對(duì)稱，呈現(xiàn)更好的GPC行為。而且，PVP相對(duì)分子質(zhì)量越大，甲醇對(duì)峰型改善效果越明顯。這些現(xiàn)象都說明在增加了疏水性的流動(dòng)相中，PVP的分子形態(tài)更加舒展，不同相對(duì)分子質(zhì)量的組分能夠得到更好地分離，這也說明疏水作用對(duì)PVP在色譜柱上的分離有明顯影響。

2.2 普適校正方法

2.2.1進(jìn)樣量的影響

將K90樣品分別按照10、20、50、100 μL的進(jìn)樣量注入色譜系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果見圖5和表1。

圖5 不同進(jìn)樣量對(duì)GPC色譜圖的影響

表1 不同進(jìn)樣量下K90的相對(duì)分子質(zhì)量

由圖5和表1可以看到，進(jìn)樣量對(duì)樣品峰型和測(cè)試結(jié)果影響很小。但是考慮到進(jìn)樣量過小時(shí)，信號(hào)強(qiáng)度低，峰面積小，在數(shù)據(jù)處理過程中可能導(dǎo)致更大的誤差；而對(duì)于高相對(duì)分子質(zhì)量的PVP K85和K90產(chǎn)品來說，進(jìn)樣量過大時(shí)可能出現(xiàn)色譜柱“過載”，因此選擇50 μL作為進(jìn)樣量。

2.2.2重復(fù)性

分別考察了相對(duì)分子質(zhì)量較高的K60、K85、K90和BASF K85相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)試的重復(fù)性，見表2、表3。

表2 K85和BASF K85重復(fù)測(cè)試相對(duì)分子質(zhì)量數(shù)據(jù)

表3 K60和K90重復(fù)測(cè)試相對(duì)分子質(zhì)量數(shù)據(jù)

由表2和表3可以看到，測(cè)試得到的K60、K85、K90的相對(duì)分子質(zhì)量與BASF公司和Asland公司公布的數(shù)據(jù)是基本符合的[15,17]。多次測(cè)試結(jié)果的重均相對(duì)分子質(zhì)量RSD均低于5%，滿足GPC重復(fù)性±5%的要求，數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量RSD略高于重均相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)試結(jié)果，但也低于10%，滿足GPC重復(fù)性要求，說明本方法具有良好的重復(fù)性。

3 結(jié)論

①LiNO3離子強(qiáng)度0～0.4 mol/L范圍內(nèi)，增加離子強(qiáng)度有利于減少PVP樣品和色譜柱之間的吸附，提高樣品分離效率；當(dāng)離子強(qiáng)度較小時(shí)，固定相對(duì)PVP樣品吸附作用較強(qiáng)，峰型很差，沒有重復(fù)性，表現(xiàn)出非常明顯的非體積效應(yīng)；離子強(qiáng)度達(dá)到0.1 mol/L之后，固定相對(duì)PVP的吸附得到有效抑制，樣品基本能夠按體積大小分離。②采用磷酸緩沖鹽溶液作為流動(dòng)相考察了pH值為3.49～7.97范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)PVP的GPC行為。當(dāng)流動(dòng)相呈堿性即pH值為7.54和7.97時(shí)，PVP樣品分離效果較差，pH值為中性或弱酸性時(shí)即pH值=6.78和3.49時(shí)，PVP在色譜柱上分離效果較好，非體積排除效應(yīng)得到減弱。③通過增大流動(dòng)相中甲醇的比例能夠顯著改善樣品峰型，增大PVP樣品的分離程度。④以PEO/PEG為標(biāo)樣，0.1 mol/L LiNO3∶甲醇=1∶1(體積比)為流動(dòng)相，結(jié)合普適校正方法測(cè)試了K60、K85和K90樣品的相對(duì)分子質(zhì)量及其分布。使用該方法進(jìn)行測(cè)試時(shí)，進(jìn)樣量對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響不大；測(cè)試K60、K85、K90樣品重復(fù)性良好，重均相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于5%，數(shù)均分子量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%。