馮英楠 陳菲 王曉萌 王海征 林曉蘭

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的一類腫瘤，約占顱內(nèi)所有腫瘤的35.26%～60.9%[1]。膠質(zhì)瘤具有侵襲性生長、惡性程度高等特點。目前，治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤主要采取手術(shù)為主，輔助放療、化療等方法，但是膠質(zhì)瘤生存期短，死亡率高，對人類健康威脅極大。中藥因其較好的安全性和有效性在腫瘤的治療中發(fā)揮積極作用，抗瘤丸是適用于腦膠質(zhì)瘤、腦垂體瘤的輔助治療的院內(nèi)制劑，臨床應用近30年，服用的患者累計10萬余人次，于2012年獲得國家發(fā)明專利(專利號：ZL 2010 1 0234220.2)。

課題組前期研究也證實，抗瘤丸的抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞作用可能與誘導膠質(zhì)瘤細胞的凋亡相關[2-3]，提示對治療膠質(zhì)瘤有良好的開發(fā)和應用前景?？沽鐾鑳?yōu)化方-4是抗瘤丸的優(yōu)化處方之一，基于前期優(yōu)化處方研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，本實驗的抗瘤丸優(yōu)化方-4抑瘤效果較好，故本實驗進一步對抗瘤丸優(yōu)化方-4進行研究。抗瘤丸優(yōu)化方-4是在原方的基礎上，通過中醫(yī)藥專家論證，減少了6味佐使藥。本實驗通過觀察對相關指標表達的影響，進一步闡明抗瘤丸優(yōu)化方-4治療膠質(zhì)瘤的作用機制，為抗瘤丸處方優(yōu)化提供數(shù)據(jù)，為進一步開發(fā)抗瘤丸提供相關的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物與細胞

SPF級健康雄性BALB/c裸鼠，雄性，體質(zhì)量17～19 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001；人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細胞(株)，購于中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學研究所基礎醫(yī)學細胞中心(ATCC，CCL-107)。

1.2 藥物

抗瘤丸是由白花蛇舌草、半枝蓮、白英等18味中藥組成的院內(nèi)復方制劑?？沽鐾鑳?yōu)化方-4是抗瘤丸的優(yōu)化處方，由首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院藥劑科提供。陽性對照藥替莫唑胺(批號：H20080313)，購于美國先靈葆雅制藥公司。

1.3 試劑及儀器

胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(批號：20120517)，購于天津市灝洋生物制品科技有限責任公司；DMEM培養(yǎng)基(高糖)(批號：1177237)、胰蛋白酶(批號：0458)、無鈣、鎂磷酸鹽緩沖液(10×PBS，PH 7.2-7.4)(批號：20120815)，均購于北京諾博萊德科技有限公司；注射用青霉素鈉(批號：Y0302215)、注射用硫酸鏈霉素(批號：030103)，購于華北制藥股份有限公司；CD34抗體、兔抗人原始造血細胞單克隆抗體(批號：12620110)，購于北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司；VEGF抗體、rabbit IgG(批號：10CM199)，購于武漢博士德生物工程有限公司；二抗、(H+L)/HRP辣根酶標記山羊抗兔(批號：K126816A)、DAB濃縮顯色液、A液和B液(批號：ZLI-9018)、原位末端標記(TdT-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒(批號：12469600)，均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

6500型CO2培養(yǎng)箱(美國NAPCO)，TE2101L型電子天平(德國賽多利斯)，倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)，DM3000顯微鏡(德國Leica)。

1.4 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細胞的培養(yǎng)方法

U87細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基2～3天更換一次，倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況。當細胞生長至70%～80%融合時進行傳代，用0.25%胰蛋白酶消化液進行消化傳代，將培養(yǎng)基倒掉，用PBS洗兩遍，加消化液室溫下消化，倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，當細胞開始變圓，細胞間隙變大時，加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕吹打瓶底和瓶壁，按1瓶傳3瓶的比例接種，3到4天傳代一次。

1.5 模型制備

將U87細胞(5×107個細胞/只)接種到裸鼠(2只)右側(cè)腋窩、20天瘤塊長至2 cm(直徑)，無菌剝離腫瘤成2 mm×2 mm×2 mm，用套管針將瘤塊移植至裸鼠(10只)右側(cè)腋窩，用火棉膠將切口粘住。17～19天再次長至2 cm(直徑)，無菌剝離腫瘤成1 mm×1 mm×1 mm，再次移植裸鼠右側(cè)腋窩，用火棉膠將切口粘住。

1.6 分組與給藥

待動物體內(nèi)瘤塊長至80～180 mm3時，將裸鼠按瘤塊大小和體質(zhì)量采用分層隨機抽樣方法分為：模型組、陽性藥(替莫唑胺)對照組、抗瘤丸優(yōu)化方-4高、中、低劑量組，每組12只?？沽鐾鑳?yōu)化方-4高、中、低劑量組藥物濃度分別為3.4 g、1.7 g、0.85 g生藥/kg，替莫唑胺膠囊藥物濃度為43 mg/kg。各藥物組按25 mL/kg灌胃給藥，模型組給予等體積去離子水，每天1次，連續(xù)給藥20天。

1.7 指標檢測

給藥20天后處死裸鼠，取各組裸鼠的瘤塊，CD34免疫組化法染色，Weidner法計數(shù)微血管密度(microvascular density，MVD)；血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)免疫組化法染色，圖像分析測定灰度值。TUNEL法檢測凋亡細胞，計算腫瘤細胞凋亡率。

1.7.1 MVD檢測 取出經(jīng)10%福爾馬林固定，每組隨機取3個瘤塊，常規(guī)石蠟包埋、切片(每個腫塊切3張片子：第1切片取腫瘤最外側(cè)邊緣，第2切片取腫瘤正中，第3切片取前兩切片中間位置，厚度為4 μm)。CD34：(1)切片在65℃烤箱中烤片2小時，常規(guī)脫蠟至水后PBS緩沖液洗2分鐘×5次；(2)3% H2O2室溫下孵育10分鐘，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS緩沖液洗2分鐘×5次；(3)0.01M檸檬酸緩沖液(PH=6.2)中進行抗原熱修復，高壓鍋中高溫高壓修復2小時，自然冷卻后PBS緩沖液洗2分鐘×5次；(4)室溫下5%山羊血清封閉非特異性背景10分鐘，PBS緩沖液洗2分鐘×5次；(5)分別加CD34一抗(抗體用PBS稀釋，稀釋倍數(shù)1∶100)和VEGF一抗(抗體用PBS稀釋，稀釋倍數(shù)1∶20)，4℃孵育過夜，PBS緩沖液洗2分鐘×5次；(6)物素化羊抗兔IgG(二抗)，37℃孵育30分鐘，PBS緩沖液洗2分鐘×5次；(7)DAB顯色3～5分鐘，蘇木精復染2分鐘，清水沖洗干凈，鹽酸酒精快速分化，清水返藍5分鐘，逐級梯度酒精脫水、二甲苯透明，樹脂封片。

MVD計數(shù)參照Weidner法如下：先在100倍下觀察整個切片，每張切片找出3個微血管密集區(qū)，血管內(nèi)皮細胞被染成棕色，然后在200倍鏡下計數(shù)被CD34染色的微血管數(shù)目。微血管判斷標準如下：與鄰近的微血管、腫瘤細胞及其它結(jié)締組織成份不相連的、標記清晰的內(nèi)皮細胞及內(nèi)皮細胞簇均可作為一個可計數(shù)的微血管。同一微血管的內(nèi)皮細胞，如染色清晰且相互分離，也可作為單獨的微血管計數(shù)。血管腔及腔內(nèi)紅細胞的存在不是確認微血管的必備條件，對管腔直徑大于8個紅細胞或管壁有平滑肌存在的血管不進行計數(shù)。

1.7.2 VEGF灰度值檢測 VEGF免疫組化染色程序同CD34，每組選9張切片，用Leica DM顯微鏡在同一條件下觀察，每張切片上隨機選3個視野，通過Leica CAMER圖像采集系統(tǒng)(Lecia Qwin V3)采集圖像，分析測定每個視野內(nèi)30個免疫陽性反應的灰度值。VEGF陽性判定如下：VEGF為細胞漿著色，染色陽性以細胞漿呈棕色顆粒狀為標準，且著色明顯高于背景?；叶确譃?～256級，反映不同的免疫陽性反應著色強弱。測量所得灰度值越小，陽性表達越強。

1.7.3 細胞凋亡率檢測 取材、包埋、切片同CD34和VEGF，石蠟包埋切片后采用TdT介導的TUNEL法檢測凋亡細胞，具體操作按說明書進行。具體步驟如下：(1)切片常規(guī)脫蠟，二甲苯浸洗5分鐘×2次，梯度乙醇浸洗3分鐘×1次；(2)PBS漂洗2次，用proteinase K工作液處理組織15～30分鐘；(3)PBS漂洗2次，加入制備TUNEL反應混合液(處理組用50 μL TdT+450 μL熒光素標記的dUTP液混勻，模型組僅加50 μL熒光素標記的dUTP液，陽性對照組先加入100 μL DNase I，反應10分鐘，后面步驟同處理組；(4)加50 μL TUNEL反應混合液(模型組僅加50 μL熒光素標記的dUTP液)于標本上，加蓋玻片在暗濕盒中37℃反應1小時；(5)PBS漂洗3次，加50 μL converter-POD于標本上，加蓋玻片在暗濕盒中37℃反應30分鐘；(6)PBS漂洗3次，加50 μL DAB底物，反應在10分鐘；(7)PBS漂洗3次，蘇木素復染，常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

TUNEL染色切片觀察與分析:在Leica光學顯微鏡下觀察TUNEL染色，每組共取9個切片，每張切片在200倍視野下選取3個視野，計數(shù)TUNEL陽性細胞數(shù)和正常細胞數(shù)。凋亡細胞可見核中有棕褐色顆粒，凋亡細胞體積縮小，染色體斷裂成核碎片，形成膜包裹性的凋亡小體，正常細胞核呈藍色。統(tǒng)計凋亡陽性細胞所占的比例，計算腫瘤細胞凋亡率。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組U87裸鼠腫瘤組織MVD檢測

與模型對照組比較，抗瘤丸優(yōu)化方-4低劑量組、陽性藥對照組的MVD值明顯降低(P<0.05)。經(jīng)免疫組化法染色顯示，CD34低表達。見表1、圖1。

圖1 各組U87裸鼠腫瘤組織中CD34的表達(DAB，×200)

表1 給藥20天后各組U87裸鼠腫瘤組織MVD比較

2.2 各組U87裸鼠腫瘤組織VEGF檢測

與模型對照組比較，抗瘤丸優(yōu)化方-4高、中、低劑量組、陽性藥對照組移植瘤灰度值明顯增高(P<0.05)。經(jīng)免疫組化法染色顯示，VEGF低表達。見表2、圖2。

圖2 各組U87裸鼠腫瘤組織中VEGF的表達(DAB，×200)

表2 給藥20天后各組U87裸鼠腫瘤VEGF灰度值比較

2.3 各組U87裸鼠腫瘤細胞凋亡率檢測

與模型對照組比較，上述給藥組細胞凋亡率顯著增高 (P<0.05)。經(jīng)TUNEL染色，模型對照組可見少量呈棕褐色的凋亡細胞，抗瘤丸優(yōu)化方-4高、中、低劑量組、陽性藥對照組可見大量的凋亡細胞，具有明顯的促進腫瘤細胞凋亡的作用。見表3、圖3。

表3 給藥20天后各組U87裸鼠腫瘤細胞凋亡率比較

圖3 各組U87裸鼠腫瘤組織中的凋亡細胞TUNEL染色(×200)

3 討論

中醫(yī)認為膠質(zhì)瘤的發(fā)生與痰濕凝聚、氣滯血瘀、肝腎不足密切相關，主要治療法則是活血化瘀、扶正培本、健脾補腎、化痰軟堅[6]?？沽鐾枋怯?8味中藥組成的院內(nèi)制劑，其中君藥具有清熱利濕、活血化瘀的功效。臣藥配伍君藥起到清熱解毒，豁痰開竅的功效。白英等清熱利濕，解毒消腫；川貝母等潤肺祛痰開胸，利肺氣，通調(diào)水道以使痰濕下行；炒山楂等健脾開胃，可消食化積散瘀，防君臣之藥傷及脾胃。全方配伍共奏清熱解毒，活血化瘀，化痰散結(jié)之功。前期臨床研究表明，KLW可延長惡性膠質(zhì)瘤患者的生存時間，具有肯定療效，且價格低廉，有較好的開發(fā)價值和前景[7]。

MVD是指生物組織如皮膚、肌肉、器官等組織中單位密度的微血管數(shù)量。MVD在臨床上應用于惡性組織微血管新生、侵襲性以及預后評估的診斷，可以反映腫瘤的生長轉(zhuǎn)移[8]。VEGF是腫瘤血管生成的重要因子，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有密切關系[9]。王奕丹等[10]研究MVD與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關,與患者的術(shù)后生存時間呈負相關。李娜等[11]研究通過下調(diào)VEGF表達，抑制了新生血管的生成，阻斷其營養(yǎng)供應，抑制腫瘤增殖，進而發(fā)揮其抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用?？沽鐾柚邪谆ㄉ呱嗖?、半枝蓮、白英等成分已有大量的藥理學實驗證明了抗瘤機制。其中白花蛇舌草可以促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增值[12]；半枝蓮能抑制腫瘤血管生成與轉(zhuǎn)移[13]；白英可通過調(diào)控VEGF相關信號通路誘導A549細胞的凋亡[14]。實驗結(jié)果顯示，抗瘤丸優(yōu)化方-4能夠抑制VEGF的表達，降低MVD，從而抑制腫瘤組織新生血管形成，同時可以促進腫瘤細胞凋亡。

綜上所述，抗瘤丸優(yōu)化方-4對膠質(zhì)瘤有一定的作用效果，其作用機制可能與促進腫瘤細胞凋亡，抑制VEGF的表達相關，為抗瘤丸的進一步開發(fā)提供實驗依據(jù)。