盧東紅 姜海行 胡榜利 周 霞 陶 霖 盧東誠 阮仙仙

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西南寧市 530021)

肝纖維化是各種慢性致病因素所致慢性肝損傷后，由于組織發(fā)生修復(fù)反應(yīng)時外基質(zhì)合成、降解和沉積不平衡而引起的病理過程。輔助性T細(xì)胞22(T helper cells 22,Th22) 是新發(fā)現(xiàn)的效應(yīng)CD4+T 細(xì)胞亞群，參與多種免疫疾病的發(fā)生發(fā)展，它為治療慢性皮膚炎癥以及哮喘等提供了新的思路。有研究發(fā)現(xiàn)微小RNA-200a(micro RNA-200a，miR-200a)在肝纖維化、肝硬化及肝癌中的表達(dá)下調(diào)，但關(guān)于miR-200a與Th22細(xì)胞相互關(guān)系的報道甚少。本研究通過建立四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)誘導(dǎo)肝纖維化模型，并檢測肝纖維化小鼠脾臟Th22 細(xì)胞表達(dá)水平及肝纖維化小鼠肝組織IL-22和miR-200a的表達(dá)量，初步探討Th22細(xì)胞及miR-200a在肝纖維化發(fā)病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 無特定病原體的雄性BALB/c小鼠(8周齡)，體重約25 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供；CCl4和橄欖油購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國 GIBCO 公司；乙酸肉豆蔻佛波醇和離子霉素購自美國Sigma公司；大鼠抗小鼠CD4單克隆抗體購自美國 BD Pharmingen公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型的建立 將40只雄性BALB/c小鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組和模型組，每組20只。采用CCl4腹腔注射法建立小鼠肝纖維化模型。對照組腹腔內(nèi)注射橄欖油，2 mg/kg，2次/周；模型組腹腔內(nèi)注射CCl4溶液(橄欖油配制)，濃度20%，2 mg/kg，2次/周。兩組小鼠分別于8周后處死， 留取脾和肝臟。

1.2.2 肝組織HE和Masson染色 取肝臟后立即放入4%甲醛溶液中固定，24 h內(nèi)制成蠟塊。蠟塊切片，常規(guī)HE和Masson染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.3 肝臟組織中α-平滑肌肌動蛋白表達(dá)的檢測 采用免疫組化SP法：切片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)、一抗4 ℃過夜、二抗溫育、DAB顯色、蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡檢。使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)半定量測定α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達(dá)，計算平均光密度值，取同一標(biāo)本三張切片測量值的均值。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾臟 Th22細(xì)胞 取下小鼠脾臟置于PBS緩沖液中剪碎、研磨，制成脾單細(xì)胞懸液。用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，用RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)調(diào)整淋巴細(xì)胞濃度為1×106/mL，以24孔板作培養(yǎng)載體，加入PMA(25 ng/mL)、離子霉素 (1 μg/mL)和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑 (1.7 μg/mL)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育5 h。收集細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞表面CD4分子染色，破膜劑破膜后加AF488-IFN-γ抗體、APC-IL-17抗體和PE-IL-22抗體，向相應(yīng)對照管內(nèi)加同型對照抗體，4 ℃避光孵育30 min，用1%多聚甲醛避光固定，24 h內(nèi)用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。結(jié)果采用Flowjo 7.6.1軟件進(jìn)行分析。IL-22+IL-17-IFN-γ-CD4+定義為Th22細(xì)胞。

1.2.5 RT-PCR檢測肝組織IL-22和miR-200a mRNA的表達(dá) 肝臟組織取材后保存于-80 ℃冰箱。以TRIZOL試劑提取肝組織總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，放-20 ℃冰箱保存。實時熒光定量PCR擴(kuò)增IL-22和miR-200a mRNA，以β-肌動蛋白作為內(nèi)參照基因。IL-22引物序列：F-CGA TTG GGG AAC TGG ACC TG，R-GGA CGT TAG CTT CTC ACT TT；miR-200a引物序列：F-CCT ACG CCA CCA TTA ACA AGC C，R-GCC GTC TAA CAC TGT CTG GTA；β-肌動蛋白引物序列：F-AAT TCC ATC ATG AAG TGT GA，R-ACT CCT GCT TGC TGA TCC AC。所有數(shù)據(jù)應(yīng)用2-△△Ct相對定量分析法，三個復(fù)孔求得平均值。

2 結(jié) 果

2.1 肝纖維化小鼠模型的建立情況 HE染色鏡下所見：對照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，無變性、壞死；模型組肝細(xì)胞索排列紊亂，膠原纖維增生，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，假小葉形成。 模型組Masson染色所見與HE染色中纖維化基本一致，纖維沉積顯色為淡綠色，提示肝纖維化模型成功建立(圖1)。

圖1 兩組小鼠肝臟HE和Masson染色(×400)

2.2 肝臟組織中α-SMA的表達(dá) 兩組小鼠的肝組織可見α-SMA大量表達(dá)(圖2)，模型組的α-SMA表達(dá)(0.48±0.02)明顯高于對照組(0.08±0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=76.461，P<0.001)。

圖2 兩組小鼠肝組織α-SMA免疫組織化學(xué)染色(×400)

2.3 小鼠脾臟的Th22細(xì)胞亞群比例 兩組小鼠的Th22細(xì)胞亞群比例明顯升高(圖3)，模型組的小鼠脾臟Th22細(xì)胞亞群比例(12.83±1.04)高于對照組(1.98±0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=46.740，P<0.001)。

圖3 兩組小鼠Th22細(xì)胞代表性的圖像

2.4 RT-PCR檢測肝組織IL-22和miR-200a mRNA的表達(dá) 模型組小鼠肝臟IL-22 mRNA相對表達(dá)量高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；模型組小鼠肝臟miR-200a mRNA相對表達(dá)量明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組小鼠肝組織IL-22、miR-200a mRNA 的表達(dá) ()

3 討 論

肝纖維化是繼發(fā)于各種慢性致病因素(如病毒性肝炎、酒精性肝病、某些代謝性疾病等)引起的肝臟損傷和炎癥后組織修復(fù)過程中的代償反應(yīng)，是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展所共有的病理改變，其主要以細(xì)胞外基質(zhì)的過度產(chǎn)生和沉積為特點。本研究采用CCl4建立肝纖維化模型，HE及Masson染色顯示模型組的肝細(xì)胞索排列紊亂，膠原纖維增生，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，假小葉形成；模型組肝組織α-SMA的表達(dá)明顯高于對照組(P<0.05)。提示本研究采用CCl4建立肝纖維化模型成功。

Th22細(xì)胞屬于CD4+T細(xì)胞功能亞群，表達(dá)CCR6、CCR4和CCR10，分泌IL-22和TNF-α，不分泌IFN-γ、IL-4、IL-17，是獨立于Th1、Th2和Th17的細(xì)胞亞群。Th22細(xì)胞參與了自身免疫性疾病和炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展過程，例如在銀屑病[1]、狼瘡性腎炎[2]、病毒性心肌炎[3]、幽門螺桿菌相關(guān)胃疾病[4]、藥物性肝炎[5]及急性肝衰竭[6]中發(fā)揮重要的作用。我們前期對Th22細(xì)胞及其效應(yīng)因子IL-22在肝纖維化發(fā)生作用機制的研究發(fā)現(xiàn)：乙型肝炎(乙肝)肝纖維化患者外周血Th22細(xì)胞占CD4+淋巴細(xì)胞比例明顯高于慢性乙肝患者和健康對照人群；乙肝肝纖維化患者CCR4+Th22、CCR6+Th22、CCR10+Th22細(xì)胞占Th22細(xì)胞比例顯著高于慢性乙肝患者和健康對照人群。Th22主要分泌 IL-22，這是一種特殊的免疫調(diào)節(jié)因子，屬于白介素10家族細(xì)胞因子。 IL-22參與多種疾病的病理生理過程，它通過受體激活下游信號通路發(fā)揮生物學(xué)作用。IL-22的受體復(fù)合物是IL-10R2與IL-22R1構(gòu)成的異源二聚體，IL-22與其受體結(jié)合后，激活JAK/STAT通路，通過STAT3活化發(fā)揮作用。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化小鼠體內(nèi)IL-22及其特異性受體 IL-22R1和 IL-10R2明顯升高，提示肝星狀細(xì)胞中IL-10R2和IL-22R1呈高表達(dá)。肝組織中除了肝細(xì)胞，肝星狀細(xì)胞也是IL-22的靶細(xì)胞。研究表明，IL-22治療可阻止T細(xì)胞性肝炎的發(fā)展、刺激肝臟再生[7]，延緩脂肪肝的進(jìn)展[8-9]，誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞的衰老，從而改善肝纖維化發(fā)生[10]。本研究中模型組小鼠第 8 周可檢測到脾臟 Th22細(xì)胞比例升高及肝臟組織的IL-22 mRNA 水平升高，提示Th22細(xì)胞和IL-22參與了肝纖維化的發(fā)病過程，Th22細(xì)胞分化可能與肝纖維化發(fā)病過程中肝臟的自身免疫反應(yīng)有關(guān)。

miR-200主要參與蛋白磷酸化、DNA結(jié)合、RNA代謝調(diào)控、小泡碎片過程。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-200a在肝纖維化、肝硬化及肝癌中的表達(dá)下調(diào)，且隨著肝纖維化進(jìn)展及其程度加深，miR-200a的表達(dá)會更低[11-15]。肝癌患者miR-200a表達(dá)降低，且miR-200a低表達(dá)者的預(yù)后較高表達(dá)者好，機理是miR-200a經(jīng)靶基因MACC1發(fā)揮了抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用[16]。另外有研究發(fā)現(xiàn)在大鼠肝纖維化模型中，miR-200a 可以通過Wnt/β-catenin和TGF-β通路降低肝星狀細(xì)胞活性，從而減緩肝纖維化的發(fā)展[17]。miRNAs在不同疾病中對輔助T細(xì)胞有一定的調(diào)控作用。對實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型的研究表明，miR-20b的異位表達(dá)可抑制Th17細(xì)胞在體外的分化，體內(nèi)過表達(dá)miR-20b可導(dǎo)致Th17細(xì)胞數(shù)量下降，并減輕自身免疫性腦脊髓炎的嚴(yán)重程度[18]。在小鼠肝炎模型中，使用miR-let-7a 預(yù)處理后，小鼠肝組織中的Th17細(xì)胞顯著下降，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量明顯上升[19]。本研究結(jié)果顯示，小鼠模型組肝臟組織的miR-200a mRNA的相對表達(dá)量明顯低于對照組(P<0.05)，提示miR-200a參與了肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，但是肝纖維化免疫微環(huán)境中的miR-200a對Th22細(xì)胞的調(diào)控機制尚未明確，需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，肝纖維化小鼠的脾臟Th22細(xì)胞亞群比例明顯升高，肝纖維化小鼠肝臟組織中IL-22呈高表達(dá)，但是肝纖維化小鼠肝臟組織中miR-200a呈低表達(dá)，Th22細(xì)胞和miR-200a mRNA是否存在交互作用協(xié)同參與肝纖維化的進(jìn)展還有待進(jìn)一步的研究證實。