王 鑫，薛 莉，崔長富，燕 飛，張 妮，李轉(zhuǎn)會

(中國兵器工業(yè)五二一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,西安 710065)

老年人易患多種腦血管疾病，隨著我國老齡化人口的不斷增加，這些疾病的發(fā)病率逐漸上升，尤其是急性腦梗死[1]。急性腦梗死的發(fā)生主要是由于一系列血液循環(huán)障礙，導致腦缺血壞死或腦組織軟化[2-3]。急性腦梗死的發(fā)病率很高，發(fā)病后若不及時有效治療，病情發(fā)展迅速，病死率較高[4]。雖然CT和MRI對急性腦梗死有較高的診斷價值，但應用血清學指標仍是預測和診斷急性腦梗死的理想方法[5]。 MicroRNA(miR)是一類小的非編碼RNA，其主要功能是調(diào)節(jié)基因表達，幾乎參與了器官形成、造血、細胞增殖和凋亡、腫瘤等所有生物過程[5-6]。miR在心血管疾病的病理生理調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，其與腦缺血再灌注損傷有關(guān)，也與神經(jīng)元細胞凋亡有關(guān)[7]。因此，血清中miR可能作為急性腦梗死的生物標志物。研究發(fā)現(xiàn)了一些腦特異性的miR，通過比較胚胎神經(jīng)細胞和星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)中的表達，miR-23被證實具有星形膠質(zhì)細胞特異性[8]。有研究[9]表明，miR-23a能減輕大腦中動脈缺血再灌注損傷大鼠的氧化應激反應。本研究收集本院臨床患者的資料觀察急性腦梗死患者血清中miR-23a的表達及其與病情嚴重程度的關(guān)系，探討其對3個月預后的相關(guān)性，為急性腦梗死的診斷和治療提供新的靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2020年1月期間中國兵器工業(yè)五二一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的急性腦梗死患者160例作為研究組，收集同期于本院進行健康體檢的非腦梗死患者120例為對照組。研究組納入標準：1)急性腦梗死患者均符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》中關(guān)于急性腦梗死的診斷標準，經(jīng)頭顱MRI或頭部CT檢查確診；2)首次發(fā)病，發(fā)病時間不超過72 h；3)患者年齡不小于18歲；4)無嚴重心肺肝腎功能不全者；5)自愿參加本研究并簽署知情同意書。非腦梗死對照組患者經(jīng)頭顱MRI或頭部CT檢查排除急性腦梗死灶和陳舊性梗死灶。所有研究對象的排除標準：1)既往有急性腦梗死病史或外傷性急性腦梗死患者；2)有精神疾病患者；3)惡性腫瘤或自身免疫性疾病患者；4)有認知障礙者(蒙特利爾認知量表對患者的認知功能進行評估,若患者的受教育年限≤12年則加1分,評分≥26分為正常,若評分<26分為障礙)；5)臨床資料不完整患者。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，所有納入研究的患者均簽署知情同意書。

1.2 miR-23a的測定

住院患者入院后第2天清晨空腹抽取肘靜脈血約4 mL，立即用離心機3500 r·min-1離心15 min，吸取上清液置于-20 ℃冰箱保存。所有標本收集完畢后，向200 μL上清液中加入1 mL Trizol裂解液室溫裂解5 min。然后加入200 μL氯仿，室溫放置15 min，用超速低溫離心機12 000 r·min-1，4 ℃離心15 min。吸取上層水相加入等體積異丙醇，過夜沉淀。離心機12 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，倒掉上清，用1 mL 75%乙醇(DEPC水配制)洗滌沉淀，8000 r·min-1，4 ℃離心5 min，重復操作2次，晾干沉淀。用適量DEPC處理的水溶解RNA。用Nanodrop2000測定總RNA 濃度。然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒( 購于TAKARA中國公司) 將總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，得到模板單鏈cDNA。然后使用 qPCR試劑盒(購自東洋紡生物科技有限公司)對cDNA 進行實時熒光定量PCR。miR-23a引物F:CCGCCGGGATCCACGGCGGGCTGGGGTTCC。R:CCGCCGAAGCTTCAGAGCTCAGGGTCGGTTGG；用U6作內(nèi)參，U6引物F:GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT。R：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。按照TOYOBO One-step RT-PCR 試劑盒說明書配制10 μL體系，反應條件：90 ℃ 30 s →60 ℃ 30 min →94 ℃ 1 min→(94 ℃ 30 s → 60 ℃ 30 s → 72 ℃ 1 min)×40循環(huán)→72 ℃ 1 min，收集熒光信號。每個樣品做3個平行孔。mRNA的表達量采用2-△△CT表示，其中△CT=(miR-23a平均CT)-(U6平均CT)，△△CT為(研究組miR-23a的△CT)-(對照組miR-23a△CT)，CT值為熒光信號在每個PCR管內(nèi)到達設定閾值的循環(huán)數(shù)。

1.3 觀察指標

收集所有入組患者的臨床資料，包括年齡、性別、吸煙史、飲酒史、疾病史(高血壓、高脂血癥、糖尿病、房顫史)等。入院治療48 h后根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS評分)進行入院評分[10]。患者出院后3個月采取電話或者門診復診方式回訪，根據(jù)改良Rankin量表進行評分，mRS≤2分為預后良好，mRS>2分為預后不良[11]。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)均采用SPSS23.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用t檢驗。定性資料采用χ2檢驗。采用多因素logistic回歸分析預后的影響因素；采用ROC曲線下面積(AUC)評估血清miR-23a對腦梗死預后的預測價值，計算約登指數(shù)確定最佳截斷值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

對照組和研究組年齡、性別、吸煙史、飲酒史和糖尿病、房顫患病史均無明顯差異(P>0.05)。研究組高血壓、高脂血癥患病史和NIHSS評分均升高，血清miR-23a表達水平低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 對照組和研究組臨床資料比較 n,%

2.2 腦梗死嚴重程度與miR-23a表達的相關(guān)性

將NIHSS評分和腦梗死患者血清中miR-23a的表達水平進行Spearman相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，腦梗死患者血清中miR-23a表達水平與NIHSS評分呈負相關(guān)(r=-0.52，P=0.037)。

2.3 腦梗死患者預后的影響因素

對出院3個月的患者進行電話隨訪，其中有13例患者沒有隨訪成功。其余147例根據(jù)改良Rankin量表進行評分，預后不良組(n=63)高血壓、高脂血癥、房顫史和NIHSS評分均高于預后良好組(n=84)，血清miR-23a表達水平低于預后良好組(P<0.05)，其余因素比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.4 影響急性腦梗死患者3個月預后因素的多因素Logistic回歸分析

對表2中有統(tǒng)計學意義的影響因素進行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，入院NIHSS評分是急性腦梗死預后不良的獨立危險因素(OR=6.526，P<0.05)，血清miR-23a是急性腦梗死預后的保護因素(OR=6.884，P<0.05)。見表3。

表2 預后良好組和預后不良組預后因素的比較 n,%

表3 急性腦梗死患者3個月預后相關(guān)因素Logistic回歸分析

2.5 NIHSS評分和血清中miR-23a對腦梗死預后的預測價值

NIHSS評分和血清中miR-23a的表達水平對腦梗死預后預測均具有一定的預測價值，兩個指標聯(lián)合檢測預測腦梗死預后具有較高價值，ROC曲線下面積AUC為0.963(95%CI：0.924～0.985)，靈敏度和特異性分別為90.48%和91.67%，準確性為91.16%。見表4和圖1。

表4 NIHSS評分和血清中miR-23a對腦梗死的預測價值

圖1 NIHSS評分和血清中miR-23a預測腦梗死預后的ROC曲線

3 討論

大部分急性腦梗死始于腦血流中斷，導致氧和葡萄糖供應嚴重受限，引發(fā)興奮性毒性、鈣失調(diào)、氧化應激和炎癥等一系列病理反應，最終導致細胞凋亡和組織壞亡[12-13]。氧化應激與活性氧的不斷增加有關(guān)，嚴重影響腦缺血/再灌注損傷的發(fā)病機制[14]。非編碼RNA是一類遺傳、表觀遺傳學和翻譯調(diào)控因子，由microRNAs(miRNAs)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)和環(huán)狀RNA(circRNAs)組成，它們通過控制轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)揮著重要的生理和病理作用[15-16]。miRNA是長度為21～25個核苷酸的小分子，是一種豐富且進化保守的內(nèi)源性lncRNA。它們通過不完全或接近完美的堿基配對抑制和降解各自的mRNA，主要是在目標mRNA的3′未翻譯區(qū)(UTR)[17-18]。多種miRNA(miR-146a、miR-155、miR-9、miR-23a、miR-424等)在腦缺血性卒中的診斷、預后預測中的作用已經(jīng)被報道[19]，miRNAs作為疾病的生物標記被廣泛研究。過表達miR-23a通過抑制凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)表達減輕神經(jīng)元凋亡，miR-23a可以抑制多種細胞凋亡，提高細胞活性并減少腦梗死面積[20]。本研究結(jié)果亦顯示，與對照組相比，急性腦梗死患者除了高血壓、高脂血癥患病史比例和NIHSS評分升高以外，血清miR-23a表達水平降低。

NIHSS可以在急性腦梗死早期對患者病情進行評估，通常入院治療24 h后至5～7 d均可進行評估[21]。根據(jù)NIHSS評分對患者病情嚴重程度進行評分。本研究中Spearman分析結(jié)果表明NIHSS評分與血清miR-23a表達水平呈負相關(guān)(r=-0.64，P=0.041)。提示血清miR-23a表達水平對急性腦梗死嚴重程度有重要的提示意義。miR-23a在不同類型的細胞(包括間充質(zhì)干細胞、內(nèi)皮細胞、成骨細胞和腫瘤細胞)中起抗凋亡和促生長因子的作用。凋亡相關(guān)基因caspase-7、caspase-3、Fas、IRF1、Apaf-1被證實為其靶基因[9]。本研究結(jié)果顯示，急性腦梗死預后不良組血清中miR-23a表達水平低于預后良好組，腦梗死會造成神經(jīng)元損傷，miR-23a作為抗凋亡因子對神經(jīng)元起了保護作用。預后不良組外周血miR-23a表達較預后良好組明顯降低，提示miR-23a可能參與了急性腦梗死的病理過程。

腦梗死預后不良組和預后良好組的高血壓、高脂血癥和房顫病史也有差異。進一步用Logistic回歸分析驗證與急性腦梗死患者預后密切相關(guān)的因素。結(jié)果表明，入院血清miR-23a表達水平和NIHSS評分與急性腦梗死患者預后存在密切相關(guān)關(guān)系。NIHSS評分反映腦梗死的嚴重程度，腦梗死程度越嚴重患者預后越差，血清中miR-23a表達水平越高，患者預后越好，表明miR-23a對腦梗死預后起神經(jīng)保護作用。本研究擬采用ROC曲線評估血清miR-23a和NIHSS評分對腦梗死預后情況的預測價值，發(fā)現(xiàn)上述兩指標均能有效預測腦梗死發(fā)生，并且聯(lián)合檢測的預測價值最高，ROC曲線下面積AUC可達0.963，靈敏度、特異性分別為90.48%、91.67%，準確性為91.16%，建議臨床定期監(jiān)測急性腦梗死患者血清miR-23a和NIHSS評分，從而為制定早期干預措施改善患者預后提供指導。

綜上所述，急性腦梗死預后不良的患者血清中miR-23a表達水平較預后良好者降低，miR-23a表達水平與急性腦梗死嚴重程度呈負相關(guān)，NIHSS評分和血清miR-23a對腦梗死預后均具有一定的預測價值，兩者聯(lián)合檢測對腦梗死患者預后有一定指導意義。