靳倩，魏瑞娜

鄭州市第三人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000

阿爾茨海默?。╝lzheimer disease，AD）是臨床常 見的慢性進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)和形成以β-淀粉樣蛋白（beta-amyloid protein，Aβ）為主的老年斑（seruleplaque，SP）［1-2］。研究證實(shí)，Aβ能導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡，具有毒性，是發(fā)生AD的關(guān)鍵因素［3］。黃芪提取物從黃芪中提取的有效成分，具有抗感染、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等作用，但黃芪提取物對Aβ25-35誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷保護(hù)及其機(jī)制研究較少［4］?；诖?，本研究采用體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)細(xì)胞，旨在探討黃芪提取物對海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料

1.1動物SD胎鼠21只，雌性，月齡為11～14月，已孕17～18 d，體質(zhì)量（360～400）g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，動物許可證號：SCXK（瀘）2012-0002，飼養(yǎng)于25～27℃，相對濕度52%～55%，自由攝食和進(jìn)水，光照與黑暗時(shí)間為1∶1健康狀況良好。倫理批號：2020074。

1.2藥物與試劑黃芪提取物（由黃芪總苷及黃芪多糖按一定比例組成，由合肥市恒星藥物研究所提供，批號：20021018）；Aβ25-35（美國Sigma公司，批號：2019030）；40 ng·L-1多聚甲醛（北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號：20190305）；無鈣鎂D-Hanks液（美國Gibco公司，批號：20190903）。

1.3儀器CO2孵箱（美國Themo公司）；BX51型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；ZEISS LSM710型激光共聚焦顯微鏡（美國Thermo公司），取材臺（廣州華俊醫(yī)療器械公司），攤片烤片機(jī)（德國Leica公司）；干燥箱（中國上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；病理切片機(jī)（德國Micro公司）。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)選取21只已孕的SD雌性大鼠，在無菌環(huán)境下取出孕18 d SD胎鼠，頸椎脫臼處死，分離出海馬，用預(yù)冷無鈣鎂D-Hanks液洗滌，剪成小塊，置于含有0.125%胰蛋白酶培養(yǎng)皿中，放37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，緩慢搖勻消化20 min，加入含10%胎牛血清停止消化，以1 000 r·min-1離心5 min，棄上清；再次加入含10%胎牛血清的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，混勻后，過濾（50μm孔徑篩網(wǎng)），取濾液，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清；加入含50 U·L-1青霉素、50μg·L-1鏈霉素、1.2 mmol·L-1谷氨酰胺的神經(jīng)生長因子（20 mL·L-1）培養(yǎng)基，使細(xì)胞懸液濃度控制在5×105mL-1。在多聚賴氨酸包被24 h的96孔培養(yǎng)板（10μg·L-1，4℃，使用前雙蒸水清洗3次，晾干2 h）接種細(xì)胞，于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，2～3 d換一半培養(yǎng)液，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；生長7 d后，多數(shù)非神經(jīng)細(xì)胞死亡。

2.2細(xì)胞分組及觀察細(xì)胞形態(tài)變化將上述細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、模型組和黃芪提取物組，每組重復(fù)3次。對照組加入無B27神經(jīng)生長因子的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基原液，培養(yǎng)1 d；模型組在對照組基礎(chǔ)上再加入終濃度10μmol·L-1Aβ25-35，培養(yǎng)1 d；黃芪提取物組在對照組基礎(chǔ)上先加入終濃度20 mg·L-1黃芪提取物，培養(yǎng)4 h，再加入終濃度10μmol·L-1Aβ25-35培養(yǎng)20 h。在倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。

2.3檢測細(xì)胞活性按照2.2的分組方法，加入20μL MTT試劑，培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，加入150μL二甲亞砜，將培養(yǎng)板置于搖床上較低速度震搖10 min，使其結(jié)晶完全溶解，在490 nm波長下檢測吸光度值。

2.4檢測細(xì)胞中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性按照2.2的分組方法，吸取3組培養(yǎng)液，采用速率法測定上清液中LDH活性；在剩下部分加入100μL 0.9%雙蒸水配置溶液，45 min后收集液體在半自動生化分析儀上測定總LDH活性。

LDH釋放率＝上清液中LDH活性／總LDH活性

2.5檢測細(xì)胞Bax和Bcl－2蛋白表達(dá)按照2.2

的分組方法及培養(yǎng)方式，棄培養(yǎng)液，提取細(xì)胞的總蛋白并變性；然后上樣于聚丙烯酰胺凝膠加樣孔內(nèi)，120 V恒壓電泳呈溴酚藍(lán)到凝膠底部。20 V恒壓分別在50 min和120 min將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜，50 g·L-1脫脂牛奶在37℃下密封1 h。將膜分別浸入Bcl-2與Bax（1∶500）溶液中，4℃過夜。用TTBS緩沖溶液洗膜，并將膜浸入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液（1∶10 000）中反應(yīng)1 h，再用TTBS緩沖溶液洗膜，運(yùn)用化學(xué)發(fā)光法顯色，內(nèi)參用β-actin。

2.6檢測細(xì)胞胞漿鈣離子水平按照2.2的分組方法及培養(yǎng)方式，細(xì)胞經(jīng)黃芪提取物培養(yǎng)4 h后，在10 min、30 min、60 min后加入10μmol·L-1Aβ25-35分別檢測胞質(zhì)鈣離子變化情況。神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌標(biāo)本2次，F(xiàn)luo-3／AM（終濃度為2μmol·L-1，內(nèi)含0.002%的F-127）荷載，于37℃保存40 min，用D-Hank′s液洗滌細(xì)胞3次，保留少量細(xì)胞DHank′s液平衡10 min，采用激光共聚焦顯微鏡觀察。相對熒光強(qiáng)度F（%）表示。

F（%）＝ΔF／FO（FO基礎(chǔ)熒光強(qiáng)度，ΔF為加入黃芪提取物、Aβ25-35與基礎(chǔ)熒光強(qiáng)度差值）

2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的形式表示。組間計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化分析對照組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，胞體呈多極形或錐形，核不可見，折光性較強(qiáng)，突起間相互連接呈網(wǎng)狀；模型組由Aβ25-35引誘海馬神經(jīng)細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡狀態(tài)，細(xì)胞生長狀態(tài)不佳，胞體折光性降低，突起收縮或斷裂，細(xì)胞貼壁松散、脫落，部分胞體溶解或死亡；黃芪提取物組細(xì)胞生長狀態(tài)較模型組顯著改善。見圖1。

圖1 觀察海馬神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化（×400）

3.2黃芪提取物對海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性影響分析與對照組比較，模型組細(xì)胞存活率極顯著降低、LDH釋放率極顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪提取物組細(xì)胞存活率極顯著升高、LDH釋放率極顯著降低（P＜0.01）。見表1。

表1 黃芪提取物對海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性影響分析 ±s）

表1 黃芪提取物對海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性影響分析 ±s）

注：與對照組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

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3.3黃芪提取物對海馬神經(jīng)元細(xì)胞Bax和Bcl－2蛋白表達(dá)的影響與對照組比較，模型組海馬神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2／Bax極顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪提取物組神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2／Bax水平極顯著升高（P＜0.01）。見表2，圖2。

圖2 黃芪提取物對海馬神經(jīng)元細(xì)胞Bax和Bcl－2蛋白表達(dá)的影響

表2 黃芪提取物對海馬神經(jīng)元細(xì)胞Bax和Bcl－2蛋白表達(dá)的影響 （±s）

表2 黃芪提取物對海馬神經(jīng)元細(xì)胞Bax和Bcl－2蛋白表達(dá)的影響 （±s）

注：與對照組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

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3.4黃芪提取物對海馬神經(jīng)元細(xì)胞鈣離子的影響神經(jīng)元與Aβ25-35孵育后會升高胞質(zhì)鈣離子水平，在孵育10 min后升高最強(qiáng)烈。本次選擇孵育后10 min、30 min、60 min 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察。與對照組比較，模型組細(xì)胞胞漿鈣離子F值極顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芪提取物組細(xì)胞胞漿鈣離子的F值極顯著降低（P＜0.01）。見表3，圖3。

圖3 黃芪提取物對海馬神經(jīng)元細(xì)胞鈣離子的影響

表3 黃芪提取物對海馬神經(jīng)元細(xì)胞鈣離子的影響 （±s）

表3 黃芪提取物對海馬神經(jīng)元細(xì)胞鈣離子的影響 （±s）

注：與對照組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

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4 討論

AD的臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性癡呆，是與精神、性格以及行為異常的慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病［5-6］。病理學(xué)特征表現(xiàn)為神經(jīng)元內(nèi)形成神經(jīng)纖維纏結(jié)、選擇性神經(jīng)元死亡及大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)發(fā)現(xiàn)大量Aβ斑塊沉積。研究發(fā)現(xiàn)，Aβ存在神經(jīng)毒性，會使神經(jīng)細(xì)胞死亡［7-8］。大腦海馬區(qū)和學(xué)習(xí)記憶功能具有顯著相關(guān)性，是發(fā)生衰老的部位，AD病變程度最大的包括大腦海馬區(qū)［9-10］。

本研究采用體外培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞，研究AD細(xì)胞模型具有較好替代性。黃芪提取物為豆科植物膜莢黃芪和蒙古黃芪干燥根的提取物，具有補(bǔ)中益氣、扶正固本等功效［11-12］。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪提取物具有抗感染、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等作用［13-14］。LDH主要存在于中樞神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在生理方面，神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)LDH較少釋放在胞質(zhì)外，一般在神經(jīng)細(xì)胞受損后，會增加LDH釋放在胞質(zhì)外。檢測神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量簡單且能定量評價(jià)神經(jīng)細(xì)胞損傷程度的方式［15-17］。研究證實(shí)，MTT法能夠研究海馬神經(jīng)細(xì)胞活性，其原理是還原MTT為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物甲臜，在細(xì)胞中聚集，可以從側(cè)面反映活細(xì)胞數(shù)量［18-20］。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)［21］，采用MTT法可成功檢測細(xì)胞存活率。本研究結(jié)果表示，黃芪提取物組細(xì)胞存活率高于模型組，LDH釋放率明顯低于模型組。提示黃芪提取物能夠保護(hù)Aβ25-35損傷神經(jīng)細(xì)胞，抑制LDH釋放，顯著改善神經(jīng)細(xì)胞生長狀態(tài)［22］。

研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物細(xì)胞凋亡是經(jīng)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外兩種途徑，最終都會經(jīng)活化Caspase家族蛋白造成細(xì)胞裂解；細(xì)胞內(nèi)途徑主要有Bcl-2家族蛋白調(diào)控，含有促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白［23-25］。在生理方面，二者之間形成異二聚體通過中和促凋亡蛋白活性，保持平衡，Bcl-2與凋亡相關(guān)蛋白Bax參與細(xì)胞正常凋亡過程，其中Bcl-2水平升高能夠抵抗細(xì)胞凋亡，而Bax水平升高會加速細(xì)胞凋亡［26-28］。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，黃芪提取物組Bcl-2／Bax水平明顯升高。提示黃芪提取物能夠抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，與相關(guān)研究［29］結(jié)果一致。細(xì)胞內(nèi)鈣超載是造成神經(jīng)細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)損害，導(dǎo)致細(xì)胞死亡的“最后共同通路”［30-31］。本研究結(jié)果表示，經(jīng)元與Aβ25-35孵育后會升高胞質(zhì)鈣離子水平，在孵育10 min后升高最強(qiáng)烈，黃芪提取物組鈣離子水平明顯低于模型組。提示黃芪提取物對神經(jīng)元的保護(hù)作用可能與降低胞質(zhì)鈣離子水平有關(guān)?？紤]到本次樣本量較少，在胎鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞取材及體外培養(yǎng)方面存在操作繁雜等不足，可能影響研究結(jié)果準(zhǔn)確性，后期可進(jìn)一步分析。