蘇明明 沈 凱 丁 駿 寧永玲 戚春建

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，腫瘤研究所，常州213164）

樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是體內(nèi)最重要的專職抗原提呈細(xì)胞，在啟動和調(diào)節(jié)先天免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用[1-2］。腫瘤組織浸潤DC可以捕獲并加工腫瘤抗原，在趨化因子的作用下，遷移至外周淋巴器官激活初始CD4+和CD8+T 細(xì)胞以啟動特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。此外，DC還可以分泌多種趨化因子和細(xì)胞因子來介導(dǎo)其他免疫細(xì)胞募集到免疫反應(yīng)發(fā)生部位，例如IL-8、MIP、IL-6 和IL-12 等[3-4］。因此，DC 在抗腫瘤免疫中具有不可或缺的作用[5-6］。目前，基于DC 的腫瘤疫苗在全球范圍內(nèi)已廣泛應(yīng)用于臨床試驗(yàn)和治療[7］。本課題組的臨床研究結(jié)果也顯示，負(fù)載自體腫瘤抗原的DC 疫苗可以在58% 的Ⅱ/ⅢA 期ER/PR 雙陰性乳腺癌患者體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤特異性的遲發(fā)型超敏反應(yīng)，延長患者的無進(jìn)展生存期[8］。

DC 通過模式識別受體（pattern recognition re‐ceptors，PRR）如Dectin-1、TLR-4 等識別病原體及細(xì)胞內(nèi)容物等抗原信息后啟動分化、成熟，其成熟程度與免疫微環(huán)境中的信號刺激密切相關(guān)[9］。在DC的發(fā)育成熟過程中，細(xì)胞表面分子表達(dá)、細(xì)胞因子分泌和抗原加工能力都會發(fā)生顯著變化。β-葡聚糖是一種由D-葡萄糖單體通過β-糖苷鍵連接形成的多糖，存在于多種植物和微生物中。作為生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑，β-葡聚糖的抗腫瘤和抗感染活性已得到廣泛研究[10-11］。研究表明，DC 表面的Dectin-1 分子可以識別β-葡聚糖，并通過形成免疫突觸激活下游信號引發(fā)DC 免疫功能改變。本課題組前期的研究表明，β-葡聚糖可以直接誘導(dǎo)DC 成熟，驅(qū)使CD4+T 細(xì)胞向Th1 分化，促進(jìn)細(xì)胞毒T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）增殖，其下游信號與ERK、P38 等信號通路相關(guān)[12］。早在2009 年，LIU 等[13］用新鮮分離的小鼠腫瘤細(xì)胞與DC 共培養(yǎng)，誘導(dǎo)其分化為腫瘤微環(huán)境馴化DC（TEDC），抑制CD4+T 細(xì)胞的增殖，從而提高腫瘤的免疫逃逸，本課題組前期的研究表明β-葡聚糖可以促進(jìn)TEDC 成熟且抑制T 細(xì)胞分化[14］。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種長度大于200 nt且不具有蛋白質(zhì)編碼能力的RNA。lncRNA 可以調(diào)控多種細(xì)胞的發(fā)育和分化，比如心肌細(xì)胞、干細(xì)胞、上皮細(xì)胞、紅細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和多種不同免疫細(xì)胞譜系等，與主要依賴堿基互補(bǔ)性調(diào)控靶基因表達(dá)的miRNA 不同，lncRNA 涉及多種機(jī)制來調(diào)節(jié)這些生物學(xué)過程[15］。其中大多數(shù)功能需要與一種或多種RNA 結(jié)合蛋白（RNA binding protein，RBP）相互作用來實(shí)現(xiàn)[16-17］。本研究發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖激發(fā)成熟的DC 會顯著上調(diào)表達(dá)lncRNA-12753。因此，本研究探索了lncRNA12753 在β-葡聚糖誘導(dǎo)DC成熟過程中的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本研究使用的β-葡聚糖是一種源于酵母細(xì)胞壁的全葡聚糖顆粒（whole particle glu‐can，WGP），購自南京英繆賽生物科技有限公司。為了去除β-葡聚糖中可能的LPS 污染，預(yù)先使用200 mmol/L NaOH 處理20 min，徹底洗滌后，重懸于去離子水中。C57BL/6小鼠購自常州市卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司。CD4 卵清蛋白T 細(xì)胞受體轉(zhuǎn)基因OT-Ⅱ小鼠由清華大學(xué)祁海教授慷慨惠贈，所有小鼠在無特定病原體的條件下飼養(yǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 重組小鼠FMS 樣酪氨酸激酶3配體（FMS-like tyrosine kinase 3 ligand，F(xiàn)lt3L）購自Peprotech 公司；檢測IL-12p40、IL-10、IL-6、TNF-α 和IFN-γ 的ELISA 試劑盒，PE 標(biāo)記的抗小鼠CD11c 抗體，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的抗小鼠I-A/I-E（MHC Ⅱ）抗體，Per‐CP-cy5.5 標(biāo)記的抗小鼠CD86 抗體，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的抗小鼠CD40 抗體，PerCP-Cy5.5 標(biāo)記的抗小鼠CD80抗體，羧基熒光黃二乙酸鹽琥珀酰亞胺（carboxyfluo‐rescin succinimidyl ester，CFSE），PE 標(biāo)記的抗小鼠CD4 抗體、PE-cy7 標(biāo)記的抗小鼠IFN-γ 抗體以及胞內(nèi)染色固定劑、破膜劑均購自Biolegend 公司；白細(xì)胞活化混合物（leukocyte activation cocktail，LAC）購自BD Pharmingen 公司；RPMI1640 培養(yǎng)基、減血清培養(yǎng)基（Opti-MEM）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）購自Gibco 公司；胎牛血清（FBS）購自BI 公司；TRIzol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Supermix 購自Va‐zyme 公司；卵清蛋白（ovalbumin，OVA）購自Sigma-Aldrich 公 司；CD4 磁 珠 分 選 試 劑 盒、Lipofectami‐neTM2000購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓DC 培養(yǎng) 取6～8 周齡C57BL/6小鼠，CO2法處死后取其股骨和脛骨，剔除肌肉，用PBS 反復(fù)吹洗骨髓腔得到骨髓細(xì)胞。離心后，加入4 ml 紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，最后用70 μm 細(xì)胞篩過濾。使用RPMI1640 完全培養(yǎng)基（含100 ng/ml Flt3L、100 ml/L FBS、0.009 mmol/L β-巰基乙醇、10 mmol/L 丙酮酸鈉和1 mmol/L 非必需氨基酸）按細(xì)胞數(shù)1×106個/ml 重懸細(xì)胞，再按每孔3 ml 鋪至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3 天進(jìn)行半換液，第5 天收集細(xì)胞，為未成熟DC。加入100 μg/ml β-葡聚糖繼續(xù)培養(yǎng)2 d 誘導(dǎo)成熟，未刺激組設(shè)為對照。

1.2.2 測序分析 使用3種不同生長環(huán)境（正常培養(yǎng)基、正常培養(yǎng)基中加入小鼠肺癌細(xì)胞株LLC 或小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1 培養(yǎng)上清液）得到未成熟DC（N、LLC 或4T1），3 組未成熟DC 分別經(jīng)WGP 誘導(dǎo)后得到成熟DC（mN、mLLC 或m4T1）。各組收集至少5×106個細(xì)胞，預(yù)冷PBS 洗滌后，用TRIzol 處理保存送至測序公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2.3 siRNA 轉(zhuǎn)染 第3 天半換液時進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染（LipofectamineTM2000 終濃度為2 μg/ml、siRNA終濃度為0.528 μg/ml）。干擾處理48 h 后，收集細(xì)胞。lncRNA12753-siRNA 序列：F：5'-GCAAAUCAU‐UUCAGCCCAATT-3'，R：5'-UUGGGCUGAAAUGAU‐UUGCTT-3'；陰性對照（NC）序列：F：5'-UUCUCC‐GAACGUGUCACGUTT-3'，R：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。

1.2.4 實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR） 用TRIzol試劑處理細(xì)胞并提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qRT-PCR 20 μl 反應(yīng)體系包括上下游引物各1 μl、cDNA 模 板2 μl、2×SYBR Green Supermix 10 μl、ddH2O 6 μl。每組樣品設(shè)3 個復(fù)孔，經(jīng)過40 個循環(huán)擴(kuò)增后以GAPDH 為內(nèi)參計(jì)算lncRNA 組間的相對表達(dá)量，計(jì)算公式為2?ΔΔCt。GAPDH 引物序列：F：5'-CACUCAAGAUUGUCAGCAATT-3'，R：5'-UUGCUGACAAUCUUGAGUGAG-3'；lncRNA12753引物序列：F：5'-TCCTCACCTCACCGAAGCC-3'，R：5'-CAGC‐GTTGGATAAGTACCTCACA-3'。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù) 收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS 洗滌后，與熒光染料標(biāo)記的抗CD11c、CD40、CD80、CD86、MHC Ⅱ單克隆抗體和同型對照抗體4℃避光孵育30 min。PBS洗滌2次后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA） 收集各組培養(yǎng)上清液，置于?80℃以備用。按照ELISA 試劑盒的操作說明，進(jìn)行包被、一抗孵育、二抗孵育、顯色等，最后用酶標(biāo)儀測定標(biāo)準(zhǔn)品濃度和吸光度（A）值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算上清液中TNF-α、IL-12p40、IL-6、IL-10和IFN-γ的濃度。

1.2.7 T 細(xì)胞增殖分化試驗(yàn) 取6～8 周齡OT-Ⅱ小鼠脾臟和淋巴結(jié)，制備成單細(xì)胞懸液。裂解紅細(xì)胞后使用磁珠分選出CD4+T 細(xì)胞，并進(jìn)行CFSE 標(biāo)記。將T 細(xì)胞和各組DC 按照5∶1 的比例混合培養(yǎng)，同時加入100 μg/ml OVA 作為抗原。培養(yǎng)3～5 d后，加入LAC 處理4～6 h 收集細(xì)胞，表面染色后再固定破膜，進(jìn)行胞內(nèi)染色，最后使用流式細(xì)胞儀分析CD4+T細(xì)胞增殖和分化情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用Graphpad Prism7.0 軟件繪制熱圖、柱狀圖，F(xiàn)lowjo 7.60 軟件分析流式數(shù)據(jù)，String 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用分析。所有數(shù)據(jù)使用表示，兩兩組間比較使用t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成熟DC 差異表達(dá)lncRNA 的篩選 與未成熟DC 相比，3 種不同生長環(huán)境下的DC 經(jīng)WGP 誘導(dǎo)成熟后（mN vs N、mLLC vs LLC、m4T1 vs 4T1），差異性表達(dá)且變化趨勢一致的lncRNA 有9 個，上調(diào)4 個，下調(diào)5 個（圖1A）。qRT-PCR 進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證，各基因表達(dá)變化和測序結(jié)果一致。 其中發(fā)現(xiàn)Lnc-TCONS_00012753 的差異表達(dá)最顯著，與未成熟DC相比，成熟DC 中上調(diào)為7.8 倍（圖1B），因此本文選擇lncRNA12753 作為實(shí)驗(yàn)研究對象。 對lnc-RNA12753 設(shè)計(jì)了3 條siRNA 序列，分別干擾后，使用qRT-PCR 檢測評估干擾效率。 結(jié)果顯示siR‐NA5655 干擾效率最高，可以降低30%～44% 的lnc-RNA12753 的表達(dá)（圖1C），且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.201，P<0.05）。

圖1 β-葡聚糖誘導(dǎo)成熟的DC中差異表達(dá)lncRNA的篩選Fig.1 Screening of differentially expressed lncRNA in ma?ture DC stimulated by β-glucan

2.2 lncRNA12753 對WGP 誘導(dǎo)DC 表型的影響

未成熟DC 經(jīng)lncRNA12753 敲低后，再加入WGP 誘導(dǎo)，48 h 后檢測DC 表面分子的變化。結(jié)果表明，與對照組相比，干擾組DC 表面MHC Ⅱ表達(dá)水平顯著降低，對照組MFI 值為358.8±68.13，干擾組MFI 值為248.2±47.42，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同時還檢測了共刺激分子CD86、CD80、CD40 等分子的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)兩組間表達(dá)一致（圖2）。

圖2 敲低lncRNA12753 對β-葡聚糖激發(fā)DC 表面分子表達(dá)的影響Fig.2 Effect of knocking down lncRNA12753 on mole?cules expression on DCs surface stimulated by β -glucan

2.3 lncRNA12753 對WGP 誘導(dǎo)DC 產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子的影響 收集上清液并檢測TNF-α、IL-12、IL-6、IL-10 的濃度情況。使用WGP 分別激發(fā)干擾組和對照組DC后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DC中l(wèi)ncRNA12753敲低后，細(xì)胞上清液中IL-12p40 的分泌明顯減少，對照 組 為（235.7±38.72）pg/ml，干 擾 組 為（161.3±23.91）pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而IL-10 的水平顯著提高，對照組為（43.11±3.829）pg/ml，干擾組為（277.9±10.67）pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。IL-6、TNF-α也呈降低趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 敲低lncRNA12753 對β-葡聚糖激發(fā)DC 分泌細(xì)胞因子的影響Fig.3 Effect of knocking down lncRNA12753 on cyto?kines secretion of DCs stimulated by β-glucan

2.4 lncRNA12753 對WGP 誘 導(dǎo)DC 激 發(fā)T 細(xì) 胞 免疫應(yīng)答的影響 使用OT-Ⅱ小鼠來源的CD4+T 細(xì)胞來測定DC誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DC中下調(diào)lncRNA12753的表達(dá)后，其誘導(dǎo)OVA 特異性CD4+T 細(xì)胞增殖的能力顯著降低，為對照組的35%。進(jìn)一步分析這些增殖的T細(xì)胞中IFN-γ+Th1 細(xì)胞的比例，發(fā)現(xiàn)干擾組僅為對照組的50%。同時，收集DC-T細(xì)胞共培養(yǎng)上清液并檢測IFN-γ 的分泌水平，發(fā)現(xiàn)對照組為（4.173±0.6308）pg/ml，而實(shí)驗(yàn)組為（2.027±0.4969）pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。

圖4 敲低lncRNA12753 削弱β-葡聚糖激發(fā)DC 誘導(dǎo)抗原特異性Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力Fig.4 Knocking down lncRNA12753 impaired β -glucanstimulated DCs functions to elicit antigen specific Th1 cells immune responses

2.5 String 數(shù)據(jù)庫分析蛋白質(zhì)之間的相互作用根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用JASPAR 數(shù)據(jù)庫聯(lián)合UCSC數(shù)據(jù)庫預(yù)測了調(diào)控MHC Ⅱ和炎癥細(xì)胞因子（IL-6、IL-10、IL-12p40、TNF-α）表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子RBPJ、IRF7、KLF14 對上述分子的表達(dá)都有調(diào)控作用。 進(jìn)一步對lncRNA12753 進(jìn)行分析，通過BLAST 序列比對得出lncRNA12753 的靶基因?yàn)門imp3 和Syn3，將靶基因（Timp3、Syn3），MHC Ⅱ（Ciita），炎癥細(xì)胞因子（IL-12p40、IL-10、IL-6、TNF-α）和篩選的轉(zhuǎn)錄因子（RBPJ、IRF7、KLF14）輸入到String 數(shù)據(jù)庫得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）。根據(jù)目前數(shù)據(jù)庫中已有信息，lncRNA12753暫時沒有發(fā)現(xiàn)直接調(diào)控DC 中MHC Ⅱ、IL-12p40 和IL-10，但其靶基因Timp3 和上述炎癥細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子IRF7 存在著聯(lián)系（圖5A）。后續(xù)qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)表明敲低lncRNA12753后，轉(zhuǎn)錄因子IRF7發(fā)生顯著性下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明lncRNA12753和IRF7的確存在著某種調(diào)控關(guān)系，但具體調(diào)控機(jī)制等待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)（圖5B）。

圖5 String數(shù)據(jù)庫分析蛋白質(zhì)之間的相互作用（PPI）Fig.5 String database analysis of protein-protein interac?tion（PPI）

3 討論

lncRNA 是免疫系統(tǒng)中基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵因素之一，具有高度譜系特異性，調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性免疫細(xì)胞的分化及其功能[18-19］。Lnc-DC 是DC 中一組特定的長鏈非編碼RNA，WANG 等[20］曾報(bào)道下調(diào)DC 中l(wèi)ncRNA 表達(dá)后，單核細(xì)胞和小鼠骨髓細(xì)胞分化為DC的數(shù)量顯著減少，且其刺激T細(xì)胞活化的能力也降低，它通過與STAT3的C末端相互作用，阻止SHP1 對STAT3 的去磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)STAT3 信號傳導(dǎo)。ZHUANG 等[21］進(jìn)一步研究表明Lnc-DC 還會通過TLR9/STAT3信號通路調(diào)控DC的生長、凋亡和免疫應(yīng)答。在上述研究中，激發(fā)DC 成熟使用的誘導(dǎo)物為LPS。為探索lncRNA 在β-葡聚糖誘導(dǎo)DC 成熟及其免疫功能發(fā)揮中的作用，本研究使用了不同生長環(huán)境（正常和腫瘤微環(huán)境）下誘導(dǎo)產(chǎn)生的DC，經(jīng)β-葡聚糖激發(fā)后，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出了顯著上調(diào)表達(dá)的lncRNA12753。

為了明確lncRNA12753 對DC 免疫功能的影響，本研究使用siRNA技術(shù)對DC中l(wèi)ncRAN12753進(jìn)行了敲低表達(dá)，再分析其免疫狀態(tài)的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低lncRNA12753 表達(dá)后，DC 表面的MHCⅡ明顯下調(diào)。同時，這種DC 對細(xì)胞因子IL-12p40的分泌降低，而IL-10 分泌增加。成熟DC 激活T 細(xì)胞免疫應(yīng)答需要三種信號，第一信號是MHC分子與抗原肽結(jié)合形成的復(fù)合物，將抗原信息傳遞給T 細(xì)胞表面受體；第二信號是DC 表面的共刺激分子CD86、CD80 和CD40 等與T 細(xì)胞表面分子如CD28等相互作用后產(chǎn)生共刺激信號；第三信號是DC 分泌產(chǎn)生的細(xì)胞因子如IL-12、TNF-α、IL-10等，直接影響T 細(xì)胞的極化方向[22-24］。其中IL-12誘導(dǎo)T 細(xì)胞向Th1 分化，而IL-10 誘導(dǎo)細(xì)胞向Th2 分化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，lncRNA12753 可能會影響DC 誘導(dǎo)T 細(xì)胞增殖和分化的能力。接下來，將DC 與OT-Ⅱ小鼠CD4+T 細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，證實(shí)了lncRNA12753 的表達(dá)下調(diào)確實(shí)會削弱DC 誘導(dǎo)OVA 抗原特異性CD4+T細(xì)胞增殖和向Th1細(xì)胞分化的能力。

由String 數(shù)據(jù)庫得出的結(jié)果顯示干擾素調(diào)節(jié)因子7（IRF7）是最有可能參與調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，IRF7最初是在EB 病毒感染中發(fā)現(xiàn)的，后來成為Ⅰ型干擾素（IFNs）抗病原感染的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它通過觸發(fā)病原體識別受體（PRRs）識別病原核酸的信號級聯(lián)來激活I(lǐng)RF7[25］。漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（pDC）表達(dá)IRF7，并能夠在離體TLR-9 刺激下迅速產(chǎn)生Ⅰ型IFN 和IL-12p40[26］。此 外，IRF7 的 激 活 也 可 增 加MHC Ⅱ、共刺激分子的表達(dá)以及IFN-α 和TNF-α 的產(chǎn)生[27］，但具體調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，這也是本課題組目前正在進(jìn)行的工作。

總之，本研究表明，lncRNA12753 通過調(diào)節(jié)DC表面MHC Ⅱ的表達(dá)及IL-12、IL-10 極化因子的分化，影響其誘導(dǎo)Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力，具體分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。