蘇明明 沈 凱 丁 駿 寧永玲 戚春建
(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院中心實驗室,腫瘤研究所,常州213164)
樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)是體內(nèi)最重要的專職抗原提呈細(xì)胞,在啟動和調(diào)節(jié)先天免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用[1-2]。腫瘤組織浸潤DC可以捕獲并加工腫瘤抗原,在趨化因子的作用下,遷移至外周淋巴器官激活初始CD4+和CD8+T 細(xì)胞以啟動特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。此外,DC還可以分泌多種趨化因子和細(xì)胞因子來介導(dǎo)其他免疫細(xì)胞募集到免疫反應(yīng)發(fā)生部位,例如IL-8、MIP、IL-6 和IL-12 等[3-4]。因此,DC 在抗腫瘤免疫中具有不可或缺的作用[5-6]。目前,基于DC 的腫瘤疫苗在全球范圍內(nèi)已廣泛應(yīng)用于臨床試驗和治療[7]。本課題組的臨床研究結(jié)果也顯示,負(fù)載自體腫瘤抗原的DC 疫苗可以在58% 的Ⅱ/ⅢA 期ER/PR 雙陰性乳腺癌患者體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤特異性的遲發(fā)型超敏反應(yīng),延長患者的無進展生存期[8]。
DC 通過模式識別受體(pattern recognition re‐ceptors,PRR)如Dectin-1、TLR-4 等識別病原體及細(xì)胞內(nèi)容物等抗原信息后啟動分化、成熟,其成熟程度與免疫微環(huán)境中的信號刺激密切相關(guān)[9]。在DC的發(fā)育成熟過程中,細(xì)胞表面分子表達、細(xì)胞因子分泌和抗原加工能力都會發(fā)生顯著變化。β-葡聚糖是一種由D-葡萄糖單體通過β-糖苷鍵連接形成的多糖,存在于多種植物和微生物中。作為生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑,β-葡聚糖的抗腫瘤和抗感染活性已得到廣泛研究[10-11]。研究表明,DC 表面的Dectin-1 分子可以識別β-葡聚糖,并通過形成免疫突觸激活下游信號引發(fā)DC 免疫功能改變。本課題組前期的研究表明,β-葡聚糖可以直接誘導(dǎo)DC 成熟,驅(qū)使CD4+T 細(xì)胞向Th1 分化,促進細(xì)胞毒T 淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)增殖,其下游信號與ERK、P38 等信號通路相關(guān)[12]。早在2009 年,LIU 等[13]用新鮮分離的小鼠腫瘤細(xì)胞與DC 共培養(yǎng),誘導(dǎo)其分化為腫瘤微環(huán)境馴化DC(TEDC),抑制CD4+T 細(xì)胞的增殖,從而提高腫瘤的免疫逃逸,本課題組前期的研究表明β-葡聚糖可以促進TEDC 成熟且抑制T 細(xì)胞分化[14]。
長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一種長度大于200 nt且不具有蛋白質(zhì)編碼能力的RNA。lncRNA 可以調(diào)控多種細(xì)胞的發(fā)育和分化,比如心肌細(xì)胞、干細(xì)胞、上皮細(xì)胞、紅細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和多種不同免疫細(xì)胞譜系等,與主要依賴堿基互補性調(diào)控靶基因表達的miRNA 不同,lncRNA 涉及多種機制來調(diào)節(jié)這些生物學(xué)過程[15]。其中大多數(shù)功能需要與一種或多種RNA 結(jié)合蛋白(RNA binding protein,RBP)相互作用來實現(xiàn)[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖激發(fā)成熟的DC 會顯著上調(diào)表達lncRNA-12753。因此,本研究探索了lncRNA12753 在β-葡聚糖誘導(dǎo)DC成熟過程中的作用及可能機制。
1.1 材料
1.1.1 實驗材料 本研究使用的β-葡聚糖是一種源于酵母細(xì)胞壁的全葡聚糖顆粒(whole particle glu‐can,WGP),購自南京英繆賽生物科技有限公司。為了去除β-葡聚糖中可能的LPS 污染,預(yù)先使用200 mmol/L NaOH 處理20 min,徹底洗滌后,重懸于去離子水中。C57BL/6小鼠購自常州市卡文斯實驗動物有限公司。CD4 卵清蛋白T 細(xì)胞受體轉(zhuǎn)基因OT-Ⅱ小鼠由清華大學(xué)祁海教授慷慨惠贈,所有小鼠在無特定病原體的條件下飼養(yǎng)。
1.1.2 實驗試劑 重組小鼠FMS 樣酪氨酸激酶3配體(FMS-like tyrosine kinase 3 ligand,F(xiàn)lt3L)購自Peprotech 公司;檢測IL-12p40、IL-10、IL-6、TNF-α 和IFN-γ 的ELISA 試劑盒,PE 標(biāo)記的抗小鼠CD11c 抗體,F(xiàn)ITC 標(biāo)記的抗小鼠I-A/I-E(MHC Ⅱ)抗體,Per‐CP-cy5.5 標(biāo)記的抗小鼠CD86 抗體,F(xiàn)ITC 標(biāo)記的抗小鼠CD40 抗體,PerCP-Cy5.5 標(biāo)記的抗小鼠CD80抗體,羧基熒光黃二乙酸鹽琥珀酰亞胺(carboxyfluo‐rescin succinimidyl ester,CFSE),PE 標(biāo)記的抗小鼠CD4 抗體、PE-cy7 標(biāo)記的抗小鼠IFN-γ 抗體以及胞內(nèi)染色固定劑、破膜劑均購自Biolegend 公司;白細(xì)胞活化混合物(leukocyte activation cocktail,LAC)購自BD Pharmingen 公司;RPMI1640 培養(yǎng)基、減血清培養(yǎng)基(Opti-MEM)、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)購自Gibco 公司;胎牛血清(FBS)購自BI 公司;TRIzol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Supermix 購自Va‐zyme 公司;卵清蛋白(ovalbumin,OVA)購自Sigma-Aldrich 公 司;CD4 磁 珠 分 選 試 劑 盒、Lipofectami‐neTM2000購自Invitrogen公司。
1.2 方法
1.2.1 小鼠骨髓DC 培養(yǎng) 取6~8 周齡C57BL/6小鼠,CO2法處死后取其股骨和脛骨,剔除肌肉,用PBS 反復(fù)吹洗骨髓腔得到骨髓細(xì)胞。離心后,加入4 ml 紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞,最后用70 μm 細(xì)胞篩過濾。使用RPMI1640 完全培養(yǎng)基(含100 ng/ml Flt3L、100 ml/L FBS、0.009 mmol/L β-巰基乙醇、10 mmol/L 丙酮酸鈉和1 mmol/L 非必需氨基酸)按細(xì)胞數(shù)1×106個/ml 重懸細(xì)胞,再按每孔3 ml 鋪至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3 天進行半換液,第5 天收集細(xì)胞,為未成熟DC。加入100 μg/ml β-葡聚糖繼續(xù)培養(yǎng)2 d 誘導(dǎo)成熟,未刺激組設(shè)為對照。
1.2.2 測序分析 使用3種不同生長環(huán)境(正常培養(yǎng)基、正常培養(yǎng)基中加入小鼠肺癌細(xì)胞株LLC 或小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1 培養(yǎng)上清液)得到未成熟DC(N、LLC 或4T1),3 組未成熟DC 分別經(jīng)WGP 誘導(dǎo)后得到成熟DC(mN、mLLC 或m4T1)。各組收集至少5×106個細(xì)胞,預(yù)冷PBS 洗滌后,用TRIzol 處理保存送至測序公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。
1.2.3 siRNA 轉(zhuǎn)染 第3 天半換液時進行siRNA轉(zhuǎn)染(LipofectamineTM2000 終濃度為2 μg/ml、siRNA終濃度為0.528 μg/ml)。干擾處理48 h 后,收集細(xì)胞。lncRNA12753-siRNA 序列:F:5'-GCAAAUCAU‐UUCAGCCCAATT-3',R:5'-UUGGGCUGAAAUGAU‐UUGCTT-3';陰性對照(NC)序列:F:5'-UUCUCC‐GAACGUGUCACGUTT-3',R:5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。
1.2.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 用TRIzol試劑處理細(xì)胞并提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qRT-PCR 20 μl 反應(yīng)體系包括上下游引物各1 μl、cDNA 模 板2 μl、2×SYBR Green Supermix 10 μl、ddH2O 6 μl。每組樣品設(shè)3 個復(fù)孔,經(jīng)過40 個循環(huán)擴增后以GAPDH 為內(nèi)參計算lncRNA 組間的相對表達量,計算公式為2?ΔΔCt。GAPDH 引物序列:F:5'-CACUCAAGAUUGUCAGCAATT-3',R:5'-UUGCUGACAAUCUUGAGUGAG-3';lncRNA12753引物序列:F:5'-TCCTCACCTCACCGAAGCC-3',R:5'-CAGC‐GTTGGATAAGTACCTCACA-3'。
1.2.5 流式細(xì)胞術(shù) 收集細(xì)胞,預(yù)冷PBS 洗滌后,與熒光染料標(biāo)記的抗CD11c、CD40、CD80、CD86、MHC Ⅱ單克隆抗體和同型對照抗體4℃避光孵育30 min。PBS洗滌2次后,用流式細(xì)胞儀進行分析。
1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA) 收集各組培養(yǎng)上清液,置于?80℃以備用。按照ELISA 試劑盒的操作說明,進行包被、一抗孵育、二抗孵育、顯色等,最后用酶標(biāo)儀測定標(biāo)準(zhǔn)品濃度和吸光度(A)值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算上清液中TNF-α、IL-12p40、IL-6、IL-10和IFN-γ的濃度。
1.2.7 T 細(xì)胞增殖分化試驗 取6~8 周齡OT-Ⅱ小鼠脾臟和淋巴結(jié),制備成單細(xì)胞懸液。裂解紅細(xì)胞后使用磁珠分選出CD4+T 細(xì)胞,并進行CFSE 標(biāo)記。將T 細(xì)胞和各組DC 按照5∶1 的比例混合培養(yǎng),同時加入100 μg/ml OVA 作為抗原。培養(yǎng)3~5 d后,加入LAC 處理4~6 h 收集細(xì)胞,表面染色后再固定破膜,進行胞內(nèi)染色,最后使用流式細(xì)胞儀分析CD4+T細(xì)胞增殖和分化情況。
1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用Graphpad Prism7.0 軟件繪制熱圖、柱狀圖,F(xiàn)lowjo 7.60 軟件分析流式數(shù)據(jù),String 數(shù)據(jù)庫進行蛋白質(zhì)相互作用分析。所有數(shù)據(jù)使用表示,兩兩組間比較使用t檢驗,P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 成熟DC 差異表達lncRNA 的篩選 與未成熟DC 相比,3 種不同生長環(huán)境下的DC 經(jīng)WGP 誘導(dǎo)成熟后(mN vs N、mLLC vs LLC、m4T1 vs 4T1),差異性表達且變化趨勢一致的lncRNA 有9 個,上調(diào)4 個,下調(diào)5 個(圖1A)。qRT-PCR 進一步進行驗證,各基因表達變化和測序結(jié)果一致。 其中發(fā)現(xiàn)Lnc-TCONS_00012753 的差異表達最顯著,與未成熟DC相比,成熟DC 中上調(diào)為7.8 倍(圖1B),因此本文選擇lncRNA12753 作為實驗研究對象。 對lnc-RNA12753 設(shè)計了3 條siRNA 序列,分別干擾后,使用qRT-PCR 檢測評估干擾效率。 結(jié)果顯示siR‐NA5655 干擾效率最高,可以降低30%~44% 的lnc-RNA12753 的表達(圖1C),且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.201,P<0.05)。
圖1 β-葡聚糖誘導(dǎo)成熟的DC中差異表達lncRNA的篩選Fig.1 Screening of differentially expressed lncRNA in ma?ture DC stimulated by β-glucan
2.2 lncRNA12753 對WGP 誘導(dǎo)DC 表型的影響
未成熟DC 經(jīng)lncRNA12753 敲低后,再加入WGP 誘導(dǎo),48 h 后檢測DC 表面分子的變化。結(jié)果表明,與對照組相比,干擾組DC 表面MHC Ⅱ表達水平顯著降低,對照組MFI 值為358.8±68.13,干擾組MFI 值為248.2±47.42,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時還檢測了共刺激分子CD86、CD80、CD40 等分子的表達情況,發(fā)現(xiàn)兩組間表達一致(圖2)。
圖2 敲低lncRNA12753 對β-葡聚糖激發(fā)DC 表面分子表達的影響Fig.2 Effect of knocking down lncRNA12753 on mole?cules expression on DCs surface stimulated by β -glucan
2.3 lncRNA12753 對WGP 誘導(dǎo)DC 產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子的影響 收集上清液并檢測TNF-α、IL-12、IL-6、IL-10 的濃度情況。使用WGP 分別激發(fā)干擾組和對照組DC后,實驗結(jié)果表明,DC中l(wèi)ncRNA12753敲低后,細(xì)胞上清液中IL-12p40 的分泌明顯減少,對照 組 為(235.7±38.72)pg/ml,干 擾 組 為(161.3±23.91)pg/ml,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而IL-10 的水平顯著提高,對照組為(43.11±3.829)pg/ml,干擾組為(277.9±10.67)pg/ml,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。IL-6、TNF-α也呈降低趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
圖3 敲低lncRNA12753 對β-葡聚糖激發(fā)DC 分泌細(xì)胞因子的影響Fig.3 Effect of knocking down lncRNA12753 on cyto?kines secretion of DCs stimulated by β-glucan
2.4 lncRNA12753 對WGP 誘 導(dǎo)DC 激 發(fā)T 細(xì) 胞 免疫應(yīng)答的影響 使用OT-Ⅱ小鼠來源的CD4+T 細(xì)胞來測定DC誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。增殖實驗結(jié)果表明,DC中下調(diào)lncRNA12753的表達后,其誘導(dǎo)OVA 特異性CD4+T 細(xì)胞增殖的能力顯著降低,為對照組的35%。進一步分析這些增殖的T細(xì)胞中IFN-γ+Th1 細(xì)胞的比例,發(fā)現(xiàn)干擾組僅為對照組的50%。同時,收集DC-T細(xì)胞共培養(yǎng)上清液并檢測IFN-γ 的分泌水平,發(fā)現(xiàn)對照組為(4.173±0.6308)pg/ml,而實驗組為(2.027±0.4969)pg/ml,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖4)。
圖4 敲低lncRNA12753 削弱β-葡聚糖激發(fā)DC 誘導(dǎo)抗原特異性Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力Fig.4 Knocking down lncRNA12753 impaired β -glucanstimulated DCs functions to elicit antigen specific Th1 cells immune responses
2.5 String 數(shù)據(jù)庫分析蛋白質(zhì)之間的相互作用根據(jù)上述實驗結(jié)果,用JASPAR 數(shù)據(jù)庫聯(lián)合UCSC數(shù)據(jù)庫預(yù)測了調(diào)控MHC Ⅱ和炎癥細(xì)胞因子(IL-6、IL-10、IL-12p40、TNF-α)表達的轉(zhuǎn)錄因子,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子RBPJ、IRF7、KLF14 對上述分子的表達都有調(diào)控作用。 進一步對lncRNA12753 進行分析,通過BLAST 序列比對得出lncRNA12753 的靶基因為Timp3 和Syn3,將靶基因(Timp3、Syn3),MHC Ⅱ(Ciita),炎癥細(xì)胞因子(IL-12p40、IL-10、IL-6、TNF-α)和篩選的轉(zhuǎn)錄因子(RBPJ、IRF7、KLF14)輸入到String 數(shù)據(jù)庫得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)。根據(jù)目前數(shù)據(jù)庫中已有信息,lncRNA12753暫時沒有發(fā)現(xiàn)直接調(diào)控DC 中MHC Ⅱ、IL-12p40 和IL-10,但其靶基因Timp3 和上述炎癥細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子IRF7 存在著聯(lián)系(圖5A)。后續(xù)qRT-PCR 實驗表明敲低lncRNA12753后,轉(zhuǎn)錄因子IRF7發(fā)生顯著性下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,說明lncRNA12753和IRF7的確存在著某種調(diào)控關(guān)系,但具體調(diào)控機制等待進一步實驗(圖5B)。
圖5 String數(shù)據(jù)庫分析蛋白質(zhì)之間的相互作用(PPI)Fig.5 String database analysis of protein-protein interac?tion(PPI)
lncRNA 是免疫系統(tǒng)中基因表達調(diào)控的關(guān)鍵因素之一,具有高度譜系特異性,調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性免疫細(xì)胞的分化及其功能[18-19]。Lnc-DC 是DC 中一組特定的長鏈非編碼RNA,WANG 等[20]曾報道下調(diào)DC 中l(wèi)ncRNA 表達后,單核細(xì)胞和小鼠骨髓細(xì)胞分化為DC的數(shù)量顯著減少,且其刺激T細(xì)胞活化的能力也降低,它通過與STAT3的C末端相互作用,阻止SHP1 對STAT3 的去磷酸化,進而促進STAT3 信號傳導(dǎo)。ZHUANG 等[21]進一步研究表明Lnc-DC 還會通過TLR9/STAT3信號通路調(diào)控DC的生長、凋亡和免疫應(yīng)答。在上述研究中,激發(fā)DC 成熟使用的誘導(dǎo)物為LPS。為探索lncRNA 在β-葡聚糖誘導(dǎo)DC 成熟及其免疫功能發(fā)揮中的作用,本研究使用了不同生長環(huán)境(正常和腫瘤微環(huán)境)下誘導(dǎo)產(chǎn)生的DC,經(jīng)β-葡聚糖激發(fā)后,進行轉(zhuǎn)錄組測序,篩選出了顯著上調(diào)表達的lncRNA12753。
為了明確lncRNA12753 對DC 免疫功能的影響,本研究使用siRNA技術(shù)對DC中l(wèi)ncRAN12753進行了敲低表達,再分析其免疫狀態(tài)的變化。實驗結(jié)果表明,敲低lncRNA12753 表達后,DC 表面的MHCⅡ明顯下調(diào)。同時,這種DC 對細(xì)胞因子IL-12p40的分泌降低,而IL-10 分泌增加。成熟DC 激活T 細(xì)胞免疫應(yīng)答需要三種信號,第一信號是MHC分子與抗原肽結(jié)合形成的復(fù)合物,將抗原信息傳遞給T 細(xì)胞表面受體;第二信號是DC 表面的共刺激分子CD86、CD80 和CD40 等與T 細(xì)胞表面分子如CD28等相互作用后產(chǎn)生共刺激信號;第三信號是DC 分泌產(chǎn)生的細(xì)胞因子如IL-12、TNF-α、IL-10等,直接影響T 細(xì)胞的極化方向[22-24]。其中IL-12誘導(dǎo)T 細(xì)胞向Th1 分化,而IL-10 誘導(dǎo)細(xì)胞向Th2 分化。本實驗結(jié)果提示,lncRNA12753 可能會影響DC 誘導(dǎo)T 細(xì)胞增殖和分化的能力。接下來,將DC 與OT-Ⅱ小鼠CD4+T 細(xì)胞進行共培養(yǎng),證實了lncRNA12753 的表達下調(diào)確實會削弱DC 誘導(dǎo)OVA 抗原特異性CD4+T細(xì)胞增殖和向Th1細(xì)胞分化的能力。
由String 數(shù)據(jù)庫得出的結(jié)果顯示干擾素調(diào)節(jié)因子7(IRF7)是最有可能參與調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子,IRF7最初是在EB 病毒感染中發(fā)現(xiàn)的,后來成為Ⅰ型干擾素(IFNs)抗病原感染的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,它通過觸發(fā)病原體識別受體(PRRs)識別病原核酸的信號級聯(lián)來激活I(lǐng)RF7[25]。漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDC)表達IRF7,并能夠在離體TLR-9 刺激下迅速產(chǎn)生Ⅰ型IFN 和IL-12p40[26]。此 外,IRF7 的 激 活 也 可 增 加MHC Ⅱ、共刺激分子的表達以及IFN-α 和TNF-α 的產(chǎn)生[27],但具體調(diào)控機制尚需進一步實驗驗證,這也是本課題組目前正在進行的工作。
總之,本研究表明,lncRNA12753 通過調(diào)節(jié)DC表面MHC Ⅱ的表達及IL-12、IL-10 極化因子的分化,影響其誘導(dǎo)Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力,具體分子機制尚待進一步研究。