孫露陽(yáng) 葛鎖華 彭俊華 周 紅（江蘇大學(xué)附屬金壇醫(yī)院檢驗(yàn)科，常州213200）

乳腺癌是威脅女性生命安全的惡性腫瘤之一，隨著現(xiàn)代社會(huì)節(jié)奏的加快，乳腺癌發(fā)病率逐年上升，已嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1］。目前乳腺癌的治療方式為手術(shù)并輔以放療或化療，但術(shù)后患者預(yù)后差且極易發(fā)生轉(zhuǎn)移[2］。研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA牛磺酸上調(diào)基因1（long noncoding ribonucleic acid taurine up-regulated gene 1，LncRNA TUG1）可促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[3］。LncRNA TUG1和微小RNA-145（microRNA-145，miR-145）間的雙負(fù)反饋環(huán)促進(jìn)人膀胱癌細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換和放射抵抗性[4］。下調(diào)LncRNA TUG1的表達(dá)可通過(guò)抑制HMGB1表達(dá)來(lái)增強(qiáng)膀胱癌的放射敏感性[5］。然而，TUG1對(duì)乳腺癌細(xì)胞放射敏感性的影響仍然未知。miR-214可通過(guò)靶向抑制ATG12及其介導(dǎo)的自噬作用增加結(jié)直腸癌的放射敏感性[6］。miR-214通過(guò)抑制自噬作用提高乳腺癌細(xì)胞對(duì)他莫昔芬和富維斯特的敏感性[7］。然而，miR-214對(duì)乳腺癌放射敏感性的影響仍未完全闡明。starBase預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，TUG1與miR-214-5p具有互補(bǔ)結(jié)合的核苷酸位點(diǎn)，提示TUG1可通過(guò)充當(dāng)miR-214-5p的海綿分子調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的放射敏感性。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)TUG1的表達(dá)及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞的放射敏感性及細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，探究TUG1與miR-214-5p的靶向作用關(guān)系及其可能的作用機(jī)制，為乳腺癌診療及提高治療效果提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A與乳腺癌MCF-7細(xì)胞均自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Li‐pofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；TUG1干擾質(zhì)粒、miR-214-5p mimics、miR-214-5p抑制劑（anti-miR-214-5p）及其各自相應(yīng)的陰性對(duì)照購(gòu)自上海吉瑪生物科技有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因載體及其檢測(cè)熒光素酶活性試劑購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 研究對(duì)象及放射敏感性判定 選取2015年4月至2016年3月于本院就診的45例乳腺癌患者為研究對(duì)象，所有患者均經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)為乳腺癌，年齡為42～65歲，平均為（55.26±5.36）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期；病理學(xué)診斷為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌；患者入組前均未接受任何治療；接受放化療并接受放化療后的臨床評(píng)估；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤者；患有自身免疫性疾病者；肝、腎等重要組織器官嚴(yán)重?fù)p害者；依從性較差者。乳腺癌放射敏感性判定：根據(jù)放療后病灶變化情況進(jìn)行判定，放療后原發(fā)腫瘤或部分腫瘤未出現(xiàn)未控及復(fù)發(fā)患者作為放射敏感組（25例），腫瘤未控及出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)患者作為放射抵抗組（20例），所有患者均于手術(shù)中切取乳腺癌組織，迅速放入液氮中，術(shù)后轉(zhuǎn)移至?80℃超低溫冰箱保存。

1.2.2 放射抵抗的乳腺癌細(xì)胞MCF-7R的建立取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌MCF-7細(xì)胞，使用200 cGy射線照射細(xì)胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，每隔24 h更換1次培養(yǎng)液，待存活的細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞穩(wěn)定傳代后進(jìn)行400 cGy射線照射細(xì)胞，重復(fù)上述步驟，依次給予600 cGy、800 cGy、1000 cGy射線照射細(xì)胞，當(dāng)累積劑量達(dá)到1200 cGy時(shí)篩選具有穩(wěn)定放射抵抗性表型的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7R，MCF-7R細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞穩(wěn)定傳代5代后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞照射、轉(zhuǎn)染及分組 人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A與乳腺癌MCF-7細(xì)胞、MCF-7R細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清與青霉素-鏈霉素混合溶液的RPMI1640培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)要求用不同劑量的X射線照射，照射條件為100 cm的源靶距，10 cm×10 cm的照射野，5 Gy/min的劑量率。同時(shí)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MCF-7R細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/ml，接種于6孔板，待細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞濃度達(dá)到80%左右參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將TUG1干擾表達(dá)質(zhì)粒（TUG1 siRNA）及其陰性對(duì)照干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MCF-7R細(xì)胞，分別記為沉默TUG1組（si-TUG1）、沉默對(duì)照組（si-control）。將miR-214-5p mimics及其相應(yīng)陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染至MCF-7R細(xì)胞，分別記為過(guò)表達(dá)miR-214-5p組（miR-214-5p）、過(guò)表達(dá)miR-NC組（miR-NC），將miR-214-5p抑制劑（anti-miR-214-5p）及其陰性對(duì)照分別與TUG1 siRNA共轉(zhuǎn)染至MCF-7R細(xì)胞，分別記為沉默TUG1+抑制miR-NC組（si+TUG1+anti-miR-NC）、沉默TUG1+抑制miR-214-5p組（si-TUG1+anti+miR-214-5p）。轉(zhuǎn)染前1 d將培養(yǎng)基更換為Opti-MEM減血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染6 h后棄轉(zhuǎn)染液并將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48 h用4 Gy劑量照射各組細(xì)胞，照射48 h后檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)TUG1、miR-214-5p表達(dá) 用Trizol試劑盒提取乳腺癌組織及各組細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系共12 μl：2 μg RNA（根據(jù)RNA濃度計(jì)算加入體積），1 μl oligo（dT），4 μl反應(yīng)緩沖液，1 μl RNase抑制劑，2 μl dNTP，1 μl逆轉(zhuǎn)錄酶，ddH2O補(bǔ)足至12 μl。反應(yīng)程序設(shè)定為65℃5 min，42℃1 h，70℃5 min，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，將cDNA置于?20℃冰箱保存。按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒配置qRT-PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)體系共20 μl：SYBR 10 μl，正反向引物各0.8 μl，cDNA 1 μl，ddH2O補(bǔ)足至20 μl。置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)，反應(yīng)程序設(shè)定為95℃5 min，95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，共循環(huán)40次。采用2?ΔΔCt法計(jì)算TUG1與miR-214-5p的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn) 收集各組MCF-7與MCF-7R細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞后接種于6孔板，分別用0、2、4、6、8 Gy不同照射劑量照射細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù)，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞克隆生長(zhǎng)出現(xiàn)細(xì)胞克隆團(tuán)時(shí)，PBS洗滌10 min×3次，甲醇固定20 min，0.5%結(jié)晶紫染色15 min，置于顯微鏡下觀察有效克隆數(shù)，使用GraphPad Prism 7軟件單機(jī)多靶計(jì)算增敏比（SER），細(xì)胞克隆形成率=（有效克隆數(shù)/接種細(xì)胞）×100%，細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)=受照射細(xì)胞克隆形成率/對(duì)照細(xì)胞克隆形成率×100%。

1.2.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 轉(zhuǎn)染后各組MCF-7R細(xì)胞經(jīng)4 Gy劑量照射48 h，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞5 min×2次，加入1×Binding Buffer重懸細(xì)胞（100 μl），調(diào)整細(xì)胞密度（2×105個(gè)/ml），將195 μl細(xì)胞懸液加入檢測(cè)管內(nèi)，依次分別加入Annexin V-FITC 5 μl，避光孵育15 min，用200 μl的1×Binding Buffer洗滌細(xì)胞，4℃條件下，1000 r/min離心3 min，用190 μl的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入10 μl PI，避光孵育15 min，置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 運(yùn)用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)TUG1可能吸附的miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TUG1可能吸附miR-214-5p，將含有miR-214-5p結(jié)合位點(diǎn)的TUG13'UTR序列及其突變體插入熒光素酶報(bào)告基因載體中得到TUG1-Wt、TUG1-Mut，同 時(shí) 將MCF-7R細(xì) 胞 以1×105個(gè)/孔 接 種 于24孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)80%左右時(shí)將miR-214-5p mimic或miR-NC與TUG1-Wt、TUG1-Mut分別共轉(zhuǎn)染MCF-7R細(xì)胞，每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后加入25 μl/孔1×Pas‐sive裂解緩沖液，室溫靜置15 min后以每孔加入20 μl裂解液的密度將其加入白板中，同時(shí)加入熒光素酶緩沖液（50 μl/孔），置于多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性。加入Stop&Glo（50 μl/孔），于多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)海腎熒光素酶活性，以螢火蟲(chóng)熒光素酶活性值與海腎熒光素酶活性值的比值作為熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS21.0分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間數(shù)據(jù)比較經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布采用t檢驗(yàn)，多組間比較經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 放射抵抗的乳腺癌組織和細(xì)胞中TUG1高表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)放射敏感組與放射抵抗組患者乳腺癌組織中TUG1的表達(dá)水平。如圖1A所示，放射抵抗組患者乳腺癌組織中TUG1的表達(dá)水平較放射敏感組明顯升高（P<0.05）。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著照射劑量的增加，MCF-7R細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)與MCF-7細(xì)胞比較明顯升高（P<0.05），見(jiàn)圖1B。單擊多靶模型參數(shù)值見(jiàn)表1，MCF-7R細(xì)胞增敏比（SER）為0.829。用qRT-PCR法進(jìn)一步檢測(cè)人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A及乳腺癌MCF-7細(xì)胞、乳腺癌放射抵抗MCF-7R細(xì)胞中TUG1的表達(dá)水平，如圖1C所示，與MCF-10A相比，MCF-7細(xì)胞與MCF-7R細(xì)胞中TUG1的表達(dá)水平均明顯升高（P<0.05），與MCF-7細(xì)胞相比，MCF-7R細(xì)胞中TUG1的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。

圖1 放射抵抗的乳腺癌組織和細(xì)胞中TUG1的表達(dá)Fig.1 TUG1 expression in radioresistant breast cancer tissues and cells

表1 乳腺癌MCF-7和MCF-7R細(xì)胞的單擊多靶模型參數(shù)值Tab.1 Parameter values of single-click multi-target model for breast cancer MCF-7 and MCF-7R cells

2.2 沉默TUG1增加MCF-7R細(xì)胞的放射敏感性

利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)將si-TUG1及其陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至乳腺癌MCF-7R細(xì)胞，qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，如圖2A所示，沉默TUG1組乳腺癌MCF-7R細(xì)胞中TUG1的表達(dá)水平較沉默對(duì)照組明顯降低（P<0.05），表明轉(zhuǎn)染成功。細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默TUG1后乳腺癌MCF-7R細(xì)胞的放射敏感性，結(jié)果顯示沉默TUG1組乳腺癌MCF-7R細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)較沉默對(duì)照組明顯降低，見(jiàn)圖2B，其中照射劑量為4 Gy時(shí)乳腺癌MCF-7R細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)出現(xiàn)顯著差異，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中以4 Gy照射細(xì)胞。沉默TUG1后MCF-7R細(xì)胞單擊多靶模型的參數(shù)值見(jiàn)表2，沉默TUG1組乳腺癌MCF-7R細(xì)胞增敏比（SER）為1.440，表明沉默TUG1后可明顯增加乳腺癌MCF-7R細(xì)胞放射敏感性。

表2 沉默TUG1后MCF-7R細(xì)胞單擊多靶模型的參數(shù)值Tab.2 Parameter values of MCF-7R cell click multi-tar?get model after silencing TUG1

圖2 沉默TUG1對(duì)MCF-7R細(xì)胞放射敏感性的影響Fig.2 Effect of silencing TUG1 on radiosensitivity of MCF-7R cells

2.3 沉默TUG1促進(jìn)放射照射誘導(dǎo)的MCF-7R細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染si-TUG1及其陰性對(duì)照后用4 Gy照射劑量照射MCF-7R細(xì)胞，分別為沉默對(duì)照+4Gy組、沉默TUG1+4Gy組。流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)4 Gy照射后MCF-7R細(xì)胞的凋亡情況，如圖3所示，與沉默對(duì)照組相比，沉默TUG1組、沉默對(duì)照+4Gy組MCF-7R細(xì)胞凋亡率均明顯升高（P<0.05），與沉默對(duì)照+4Gy組相比，沉默TUG1+4Gy組MCF-7R細(xì)胞凋亡率明顯升高（P<0.05）。表明沉默TUG1后可通過(guò)促進(jìn)放射照射誘導(dǎo)的MCF-7R細(xì)胞凋亡進(jìn)而增加乳腺癌細(xì)胞放射敏感性。

圖3 沉默TUG1對(duì)輻射照射后MCF-7R細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of silencing TUG1 on apoptosis of MCF-7R cells after radiation exposure

2.4 TUG1可吸附并調(diào)控miR-214-5p的表達(dá) 靶基因網(wǎng)站預(yù)測(cè)TUG1可能吸附的miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TUG1可能靶向調(diào)控miR-214-5p，TUG1與miR-214-5p存在互補(bǔ)結(jié)合核苷酸位點(diǎn)，見(jiàn)圖4A。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)探討TUG1是否可以直接靶向miR-214-5p，結(jié)果顯示，與過(guò)表達(dá)miR-NC組相比，miR-214-5p過(guò)表達(dá)能夠明顯抑制野生型TUG1-Wt的熒光素酶活性（P<0.05），TUG1與miR-214-5p結(jié)合位點(diǎn)突變后，miR-214-5p過(guò)表達(dá)對(duì)突變型TUG1-Mut的熒光素酶活性無(wú)明顯抑制效果（P>0.05），見(jiàn)圖4B。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，沉默TUG1組乳腺癌MCF-7R細(xì)胞中miR-214-5p的表達(dá)水平較沉默對(duì)照組明顯升高（P<0.05），見(jiàn)圖4C。表明TUG1可靶向吸附miR-214-5p而抑制其表達(dá)。

圖4 TUG1可調(diào)控miR-214-5p的表達(dá)Fig.4 TUG1 can regulate expression of miR-214-5p

2.5 過(guò)表達(dá)miR-214-5p增加MCF-7R細(xì)胞的放射敏感性 qRT-PCR檢測(cè)miR-214-5p在人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A及乳腺癌MCF-7、MCF-7R細(xì)胞中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與MCF-10A細(xì)胞相比，MCF-7、MCF-7R細(xì)胞中miR-214-5p表達(dá)水平均明顯降低（P<0.05），與MCF-7細(xì)胞相比，MCF-7R細(xì)胞中miR-214-5p的表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），表明miR-214-5p表達(dá)水平的降低可能降低乳腺癌細(xì)胞放射敏感性（圖5A）。將miR-214-5p mimics及其陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至MCF-7R細(xì)胞，qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-214-5p組MCF-7R細(xì)胞中miR-214-5p的表達(dá)水平明顯高于過(guò)表達(dá)miR-NC組（P<0.05，圖5B）。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著照射劑量的增加，過(guò)表達(dá)miR-214-5p組MCF-7R細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)較過(guò)表達(dá)miR-NC組明顯降低（P<0.05，圖5C），過(guò)表達(dá)miR-214-5p后MCF-7R細(xì)胞單擊多靶模型的參數(shù)值見(jiàn)表3，過(guò)表達(dá)miR-214-5p組MCF-7R細(xì)胞增敏比（SER）為1.455。表明miR-214-5p過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞敏感性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-214-5p過(guò)表達(dá)后MCF-7R細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，與過(guò)表達(dá)miR-NC組相比，過(guò)表達(dá)miR-214-5p組與過(guò)表達(dá)miR-NC+4Gy組MCF-7R細(xì)胞凋亡率均明顯增加（P<0.05），與過(guò)表達(dá)miR-NC+4Gy組相比，過(guò)表達(dá)miR-214-5p+4Gy組MCF-7R細(xì)胞凋亡率明顯增加（P<0.05），見(jiàn)圖5D。表明miR-214-5p過(guò)表達(dá)可通過(guò)促進(jìn)放射誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡進(jìn)而增加細(xì)胞放射敏感性。

表3 過(guò)表達(dá)miR-214-5p后MCF-7R細(xì)胞單擊多靶模型的參數(shù)值Tab.3 MCF-7R cell click multi-target model parameter values after overexpression of miR-214-5p

圖5 過(guò)表達(dá)miR-214-5p對(duì)MCF-7R細(xì)胞放射敏感性的影響Fig.5 Effect of miR-214-5p overexpression on radiosensi?tivity of MCF-7R cells

2.6 抑制miR-214-5p可逆轉(zhuǎn)沉默TUG1對(duì)MCF-7R細(xì)胞放射敏感性的影響 將si-TUG1與miR-NC共轉(zhuǎn)染至MCF-7R細(xì)胞，si-TUG1與miR-214-5p抑制劑（anti-miR-214-5p）共轉(zhuǎn)染至MCF-7R細(xì)胞，以驗(yàn)證TUG1是否通過(guò)抑制miR-214-5p表達(dá)進(jìn)而降低乳腺癌細(xì)胞放射敏感性，細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默TUG1+抑制miR-214-5p組MCF-7R細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)較沉默TUG1+抑制miR-NC組明顯升高（P<0.05），見(jiàn)圖6B。抑制miR-214-5p聯(lián)合沉默TUG1后MCF-7R細(xì)胞單擊多靶模型的參數(shù)值見(jiàn)表4，沉默TUG1+抑 制miR-214-5p組MCF-7R細(xì) 胞 增 敏 比（SER）為0.713，相較于沉默TUG1組明顯降低。表明抑制miR-214-5p可逆轉(zhuǎn)沉默TUG1對(duì)MCF-7R細(xì)胞放射敏感性的增強(qiáng)作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，沉默TUG1+抑制miR-214-5p組MCF-7R細(xì)胞凋亡率較沉默TUG1+抑制miR-NC組明顯降低（P<0.05），見(jiàn)圖6C。表明抑制miR-214-5p可逆轉(zhuǎn)沉默TUG1對(duì)放射誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。

圖6 抑制miR-214-5p聯(lián)合沉默TUG1對(duì)MCF-7R細(xì)胞放射敏感性及放射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Effect of miR-214-5p combined with silencing TUG1 on radiosensitivity of MCF-7R cells and ra?diation-induced apoptosis

表4 抑制miR-214-5p聯(lián)合沉默TUG1后MCF-7R細(xì)胞單擊多靶模型的參數(shù)值Tab.4 Inhibition of miR-214-5p combined with silencing TUG1 in MCF-7R cells by clicking multi-target model parameter values

3 討論

乳腺癌的治療方式中放療技術(shù)應(yīng)用較為廣泛，在一定程度上可延長(zhǎng)乳腺癌患者生存期，但由于患者體質(zhì)或病理程度不同導(dǎo)致放療效果相差較大，部分患者甚至出現(xiàn)放療抵抗性，因此如何通過(guò)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞放射敏感性成為提高乳腺癌患者臨床治療效果的重要切入點(diǎn)[8］。研究表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA BRCA1相鄰基因2（LncRNA NBR2）在放射誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，上調(diào)LncRNA NBR2表達(dá)可通過(guò)抑制乳腺癌細(xì)胞增殖能力進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的放射敏感性[9］。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)部分LncRNA異常表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞放療敏感性有關(guān)，并可能作為腫瘤細(xì)胞放療抵抗的預(yù)測(cè)因子[10］。但仍有部分LncRNA與乳腺癌細(xì)胞放療敏感性的相關(guān)性研究尚未明確，需進(jìn)一步深入挖掘LncRNA并探討其與乳腺癌細(xì)胞放射敏感性的關(guān)系，為提高臨床治療效果提供參考。

TUG1在多種惡性腫瘤進(jìn)展中均具有重要調(diào)控作用，研究表明TUG1在乳腺癌中呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與乳腺癌患者腫瘤直徑、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等呈正相關(guān)，TUG1表達(dá)可能通過(guò)下調(diào)p27表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌生長(zhǎng)[11］。肺腺癌組織中TUG1表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)與患者惡性臨床病理特征密切相關(guān)，TUG1可能通過(guò)抑制p16表達(dá)促進(jìn)肺腺癌的發(fā)生發(fā)展[12］。提示TUG1可能作為腫瘤診斷及治療的重要分子標(biāo)志物。張桓瑜等[13］研究表明，TUG1在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲。越來(lái)越多的研究表明，TUG1可通過(guò)充當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA吸附miRNA或與RNA結(jié)合蛋白相互作用進(jìn)而調(diào)控靶基因表達(dá)，最終影響癌癥發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，TUG1可能作為腫瘤診斷及評(píng)估患者預(yù)后的重要生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)基因[14］。ZHAO等[15］研究表明TUG1可通過(guò)充當(dāng)miR-382的海綿進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移及EMT過(guò)程。LEI等[16］研究表明TUG1可通過(guò)靶向調(diào)控miR-145影響乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移及EMT過(guò)程。本研究結(jié)果表明，乳腺癌細(xì)胞中TUG1的表達(dá)水平明顯高于乳腺上皮細(xì)胞，而放射抵抗性乳腺癌MCF-7R細(xì)胞中TUG1的表達(dá)水平較乳腺癌細(xì)胞明顯升高，說(shuō)明TUG1的表達(dá)水平升高可降低乳腺癌細(xì)胞放射敏感性。本研究通過(guò)沉默TUG1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MCF-7R細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯降低，細(xì)胞增敏比明顯升高，說(shuō)明沉默TUG1表達(dá)可增加乳腺癌細(xì)胞放射敏感性，提示TUG1可能作為乳腺癌靶向治療的潛在靶點(diǎn)。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，沉默TUG1表達(dá)后經(jīng)X射線照射后乳腺癌細(xì)胞凋亡率明顯升高，說(shuō)明沉默TUG1表達(dá)可通過(guò)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡進(jìn)而增加乳腺癌細(xì)胞放射敏感性。提示TUG1高表達(dá)可通過(guò)抑制放射誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡進(jìn)而降低細(xì)胞放射敏感性。

miR-214-3p在宮頸癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，上調(diào)miR-214-3p表達(dá)后可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖，抑制miR-214-3p表達(dá)后可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為宮頸癌臨床診斷及治療提供新靶點(diǎn)[17］。研究表明miR-214-5p在胰腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，上調(diào)miR-214-5p表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞遷移及侵襲[18］。LI等[19］研究表明miR-214-5p過(guò)表達(dá)可抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞遷移及侵襲。miR-214-5p可靶向抑制ROCK1表達(dá)進(jìn)而抑制人骨肉瘤細(xì)胞增殖及侵襲[20］。本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞中miR-214-5p的表達(dá)水平明顯升高，其在乳腺癌放射抵抗細(xì)胞中的表達(dá)水平較乳腺癌細(xì)胞明顯降低，說(shuō)明miR-214-5p表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞放射敏感性密切相關(guān)。通過(guò)將miR-214-5p mimics轉(zhuǎn)染入放射抵抗乳腺癌MCF-7R細(xì)胞以提高miR-214-5p的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-214-5p過(guò)表達(dá)可明顯降低MCF-7R細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，促進(jìn)MCF-7R細(xì)胞凋亡，增加乳腺癌細(xì)胞放射敏感性。提示miR-214-5p過(guò)表達(dá)可明顯增加乳腺癌細(xì)胞放射敏感性。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)TUG1可吸附miR-214-5p而降低其表達(dá)，為驗(yàn)證其是否通過(guò)調(diào)控miR-214-5p表達(dá)降低乳腺癌細(xì)胞放射敏感性，將沉默TUG1與抑制miR-214-5p共轉(zhuǎn)染至MCF-7R細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染后MCF-7R細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)明顯增加，增敏比明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯降低。提示沉默TUG1可通過(guò)上調(diào)miR-214-5p表達(dá)進(jìn)而增加乳腺癌細(xì)胞放射敏感性。

綜上所述，TUG1在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，沉默TUG1可通過(guò)上調(diào)miR-214-5p表達(dá)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡并增加細(xì)胞株放射敏感性。但TUG1在乳腺癌細(xì)胞增殖、放療抵抗及凋亡中的具體作用機(jī)制尚需深入研究。