包克勇 陶曉玉 張 雪 張 莉 王 東

（內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院西醫(yī)婦科，通遼028000）

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤之一，病理組織學(xué)多數(shù)為鱗癌，少數(shù)為腺癌，近年宮頸癌發(fā)病率持續(xù)上升，并呈現(xiàn)年輕化趨勢，是導(dǎo)致婦女死亡的重要原因之一[1］。Krüpple樣轉(zhuǎn)錄因子12（Krüpple-like factor 12，KLF12）是KLF家族成員，參與脂代謝、腎臟發(fā)育、腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲遷移等過程[2-3］。多種腫瘤中KLF12異常表達(dá)，其異常表達(dá)可影響腫瘤生長[4-5］。宮頸癌中KLF12研究較少，研究發(fā)現(xiàn)，92例宮頸癌患者中大部分患者KLF12呈高表達(dá)，KLF12高表達(dá)患者5年生存率明顯降低，且KLF12高表達(dá)與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和宮旁浸潤密切相關(guān)[6］。IL-6/STAT3信號通路在多種腫瘤中異常激活，其異常激活可影響腫瘤侵襲遷移、凋亡等多種生物學(xué)過程[7-8］。本研究旨在觀察抑制KLF12表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并進(jìn)一步探討IL-6/STAT3信號通路在此過程中的作用，為宮頸癌診治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床標(biāo)本 收集2017年3月至2019年2月于我院就診的宮頸癌患者術(shù)后切除的宮頸癌組織標(biāo)本及相應(yīng)癌旁組織（距離腫瘤邊緣>3 cm）共42例，所有病例經(jīng)我院病理醫(yī)生復(fù)閱確認(rèn)，年齡36～66歲，中位年齡45歲。所有病例術(shù)前均未接受放化療及其他抗腫瘤治療，術(shù)后30 min將所有病例標(biāo)本置于液氮中凍存，?80℃保存，用于后續(xù)實驗。所有樣本采集前均得到患者知情同意，經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 細(xì)胞株 正常宮頸上皮永生化細(xì)胞End1/E6E7及宮頸癌C33A、HeLa和SiHa購自美國菌種保藏中心。

1.1.3 主要試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒購自中國碧云天公司；BCA試劑盒購自北京中杉金橋公司；KLF12、STAT3、p-STAT3、CyclinD1、Bcl-2和Bax抗體購自美國Abcam公司；CCK-8試劑購自日本同仁化學(xué)研究所；酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 正常宮頸細(xì)胞及宮頸癌細(xì)胞采用含10%胎牛血清及青霉素和鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃、5%CO2，細(xì)胞覆蓋瓶底70%左右時，胰酶消化，傳代。轉(zhuǎn)染前24 h接種生長至對數(shù)期的宮頸癌C33A細(xì)胞于6孔板，1 ml/孔加入細(xì)胞（約1×105個），生長至60%融合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染參照LipofectamineTM2000說明，KLF12特異性siRNA（si-KLF12組）、無意義siRNA（si-NC組）及Lipo‐fectamineTM2000中分別加入無血清培養(yǎng)基，將稀釋后的siRNA與LipofectamineTM2000混勻，加入6孔板相應(yīng)孔，僅加入脂質(zhì)體的為對照組，轉(zhuǎn)染后常規(guī)孵育5～6 h，更換為無抗生素含血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞KLF12表達(dá)。

1.2.2 Western blot檢測蛋白表達(dá) 提取組織，轉(zhuǎn)染si-KLF12，根據(jù)預(yù)實驗選擇的5 mg/ml重組人IL-6（RhIL-6）處理的轉(zhuǎn)染si-KLF12的細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品與上樣緩沖液混勻，100℃沸水中變性5 min，40 μg/孔加入變性蛋白，SDS-PAGE分離蛋白（220 V，2 h），電泳，取出凝膠，移至電轉(zhuǎn)移槽（100 V，90 min），取下轉(zhuǎn)好的PVDF膜，根據(jù)Marker切膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。加一抗（1∶1000）4℃孵育過夜，洗膜，加HRP標(biāo)記的二抗（1∶2000）室溫孵育1 h，洗膜，ECL顯色，曝光。Bio-Rad成像系統(tǒng)分析條帶灰度值，目的蛋白相對表達(dá)=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值，實驗重復(fù)3次。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 200 μl/孔（約5×103個）接種生長至對數(shù)期的C33A細(xì)胞于96孔板，采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，采用KLF12 siRNA及KLF12 siRNA+RhIL-6處理細(xì)胞，分別在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h加入CCK-8試劑（10 μl/孔），常規(guī)孵育3 h，取出培養(yǎng)板，酶標(biāo)儀測定490 nm處各孔光密度（OD）值，實驗重復(fù)3次[9］。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡 收集經(jīng)KLF12 siRNA及KLF12 siRNA+RhIL-6處理的細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌2次，將10×Binding Buffer采用去離子水稀釋為1×Binding Buffer，1×106個/ml重懸細(xì)胞于1×Binding Buffer中，取300 μl細(xì)胞懸液，加入流式管中，加5 μl Annexin V-FITC于流式管中，微量移液器混勻，室溫（25℃）避光孵育15 min，加入5 μl PI，混勻，在流式管中加入200 μl 1×Binding Buffer，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀分析，實驗重復(fù)3次[10］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KLF12在宮頸癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)KLF12在宮頸癌組織中表達(dá)（0.622±0.063）明顯高于癌旁組織（0.083±0.012，P<0.05，圖1A），與正常宮頸上皮永生化細(xì)胞End1/E6E7（0.075±0.010）相比，宮 頸 癌C33A（0.525±0.058）、HeLa（0.201±0.022）和SiHa（0.314±0.028）細(xì)胞中KLF12表達(dá)均明顯升高（P<0.01，圖1B）。宮頸癌C33A細(xì)胞中KLF12表達(dá)最高，因此選擇C33A細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 Western blot檢測宮頸癌組織及細(xì)胞中KLF12表達(dá)Fig.1 Expression of KLF12 in cervical cancer tissues and cells detected by Western blot

2.2 C33A細(xì)胞轉(zhuǎn)染KLF12 siRNA后KLF12表達(dá)KLF12 siRNA轉(zhuǎn)染C33A細(xì)胞48 h，KLF12表達(dá)明顯低于對照組（P<0.01），si-NC組KLF12表達(dá)與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖2、表1）。

表1 C33A細(xì)胞轉(zhuǎn)染KLF12 siRNA后KLF12表達(dá)（±s）Tab.1 KLF12 expression in C33A cells transfected with KLF12 siRNA（±s）

表1 C33A細(xì)胞轉(zhuǎn)染KLF12 siRNA后KLF12表達(dá)（±s）Tab.1 KLF12 expression in C33A cells transfected with KLF12 siRNA（±s）

Note：Compared with Control，1）P<0.01.

Groups Control si-NC si-KLF12 F P KLF12 protein expression 0.688±0.0720.675±0.0690.159±0.0211）78.8950.000

圖2 Western blot檢測C33A細(xì)胞轉(zhuǎn)染KLF12 siRNA后KLF12表達(dá)Fig.2 KLF12 expression detected by Western blot after KLF12 siRNA transfected into C33A cells

2.3 抑制KLF12表達(dá)對C33A細(xì)胞增殖、凋亡的影響 si-NC組和對照組細(xì)胞活力及凋亡率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），si-KLF12組細(xì)胞活力明顯低于對照組，凋亡率高于對照組（P<0.01，圖3、表2）。

表2 抑制KLF12表達(dá)對C33A細(xì)胞增殖活力及凋亡率的影響（±s）Tab.2 Effect of inhibiting KLF12 expression on prolifera?tion activity and apoptosis rate of C33A cells（±s）

表2 抑制KLF12表達(dá)對C33A細(xì)胞增殖活力及凋亡率的影響（±s）Tab.2 Effect of inhibiting KLF12 expression on prolifera?tion activity and apoptosis rate of C33A cells（±s）

Note：Compared with Control，1）P<0.01.

Groups Control si-NC si-KLF12 F P OD490 24 h 0.489±0.0420.496±0.0450.313±0.0341）19.5690.00248 h 0.747±0.0630.734±0.0610.505±0.0481）16.6860.00472 h 0.993±0.0861.003±0.0890.710±0.0741）11.9780.008 Apoptosis rate（%）2.31±0.222.25±0.2123.46±2.131）290.7040.000

圖3 抑制KLF12表達(dá)對C33A細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of KLF12 inhibition on apoptosis of C33A cells

2.4 抑制KLF12表達(dá)對IL-6/STAT3信號通路的影響 各組細(xì)胞STAT3表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），與si-NC組相比，si-KLF12組p-STAT3表達(dá)明顯降低，si-NC+RhIL-6組p-STAT3表達(dá)明顯升高（P<0.01），與si-KLF12+RhIL-6組相比，si-KLF12組p-STAT3表 達(dá) 明 顯降低，si-NC+RhIL-6組p-STAT3表達(dá)明顯升高（P<0.01，圖4、表3）。

圖4 Western blot檢測各組C33A細(xì) 胞STAT3和p-STAT3表達(dá)Fig.4 Western blot to detect STAT3 and p-STAT3 ex?pressions of C33A cells in each group

表3 各組STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)（±s）Tab.3 Expressions of STAT3 and p-STAT3 in each group（±s）

表3 各組STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)（±s）Tab.3 Expressions of STAT3 and p-STAT3 in each group（±s）

Note：Compared with si-NC，1）P<0.01；compared with si-KLF12+Rh IL-6，2）P<0.01.

Groups si-NC si-KLF12 si-NC+RhIL-6 si-KLF12+RhIL-6 F P STAT30.283±0.0350.291±0.0270.278±0.0330.296±0.0290.2000.894 p-STAT30.102±0.0110.043±0.0061）2）0.242±0.0181）2）0.126±0.016113.4370.000

2.5 抑制KLF12表達(dá)對CyclinD1、Bcl-2和Bax表達(dá)的影響 與si-NC組相比，si-KLF12組CyclinD1和Bcl-2表達(dá)明顯降低，Bax表達(dá)明顯升高，si-NC+RhIL-6組CyclinD1和Bcl-2表達(dá)明顯升高，Bax表達(dá)明顯降低（P<0.01），與si-KLF12+RhIL-6組相比，si-KLF12組CyclinD1和Bcl-2表達(dá)明顯降低，Bax表達(dá)明顯升高，si-NC+RhIL-6組CyclinD1和Bcl-2表達(dá)明顯升高，Bax表達(dá)明顯降低（P<0.01，圖5、表4）。

圖5 Western blot檢測各組C33A細(xì)胞CyclinD1、Bcl-2和Bax表達(dá)Fig.5 Western blot to detect CyclinD1，Bcl-2 and Bax ex?pressions in C33A cells

表4 各組細(xì)胞CyclinD1、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)（±s）Tab.4 Proteins expressions of CyclinD1，Bcl-2 and Bax of cells in each group（±s）

表4 各組細(xì)胞CyclinD1、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)（±s）Tab.4 Proteins expressions of CyclinD1，Bcl-2 and Bax of cells in each group（±s）

Note：Compared with si-NC，1）P<0.01；compared with si-KLF12+RhIL-6，2）P<0.01.

Groups si-NC si-KLF12 si-NC+RhIL-6 si-KLF12+RhIL-6 F P CyclinD10.188±0.0220.096±0.0121）2）0.455±0.0431）2）0.205±0.02197.0880.000 Bcl-20.194±0.0230.072±0.0091）2）0.703±0.0681）2）0.305±0.0291）2）147.6770.000 Bax 0.296±0.0310.545±0.0561）2）0.055±0.0071）2）0.215±0.026103.9490.000

3 討論

宮頸癌發(fā)生發(fā)展是涉及多因素、多步驟、多基因的復(fù)雜過程，其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚未明確[11］。近年研究發(fā)現(xiàn)，在女性生殖道內(nèi)分泌腫瘤中KLF家族成員具有重要作用，研究顯示，子宮內(nèi)膜癌中KLF6表達(dá)降低，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者KLF6表達(dá)高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，且腫瘤浸潤程度越高，KLF6表達(dá)越低[12］。宮頸癌中KLF4表達(dá)降低，隨臨床分期進(jìn)展，其表達(dá)降低[13］。KLF12是KLF家族成員，在胃癌、胰腺癌等多種腫瘤中具有重要作用，但在宮頸癌中研究較少[14-15］。既往研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌中KLF12表達(dá)升高[6］，KLF12對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)特性及機(jī)制的影響尚未明確。為探究KLF12在宮頸癌中的作用，本研究首先檢測宮頸癌組織及不同宮頸癌細(xì)胞KLF12表達(dá)，結(jié)果顯示，宮頸癌細(xì)胞及組織中KLF12表達(dá)均明顯升高，與既往研究結(jié)果一致。由于宮頸癌C33A細(xì)胞中KLF12表達(dá)最高，因此選擇C33A細(xì)胞作為研究對象。

本研究顯示，KLF12特異性siRNA可明顯降低宮頸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，下調(diào)p-STAT3、Cy‐clinD1和Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)，且可減弱RhIL-6對p-STAT3、CyclinD1、Bcl-2和Bax表 達(dá) 的 影 響。STAT3在細(xì)胞生長中有重要作用，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[16-17］。正常細(xì)胞中，STAT3活化過程短暫，但在多種腫瘤細(xì)胞中，因細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-6）、生長因子（如TGF-β、EGF）等失調(diào)，活化后的STAT3水平異常升高，可引起細(xì)胞增殖凋亡失衡，最終導(dǎo)致 腫 瘤 發(fā) 生[18-19］。增 殖 相 關(guān) 蛋 白（如Myc、Cy‐clinD1）、凋亡相關(guān)蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL）等是STAT3的重要靶基因產(chǎn)物，IL-6/STAT3信號異常激活引起的上述基因表達(dá)異常將引腫瘤[20］。IL-6是一種細(xì)胞因子，是IL家族成員，在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞、傳遞信息、炎癥反應(yīng)、增殖和分化等過程中發(fā)揮重要作用[21-22］。提示抑制KLF12表達(dá)可能通過調(diào)控IL-6/STAT3信號途徑抑制宮頸癌細(xì)胞生長。

綜上所述，宮頸癌中KLF12表達(dá)升高，抑制其表達(dá)可降低癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與抑制IL-6/STAT3信號通路有關(guān)。本研究可能為研究KLF12在宮頸癌中的作用提供理論基礎(chǔ)，提示KLF12可能是宮頸癌診治的潛在靶標(biāo)。