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        miR-128-3p通過調控Notch1表達影響子宮內膜癌細胞的增殖和凋亡①

        2021-09-25 03:19:32顧曉荔任曉爽廖予妹鄭州大學第二附屬醫(yī)院婦產科鄭州450014
        中國免疫學雜志 2021年16期
        關鍵詞:熒光素酶細胞系靶向

        顧曉荔 任曉爽 廖予妹(鄭州大學第二附屬醫(yī)院婦產科,鄭州450014)

        子宮內膜癌(endometrial cancer,EC)是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率逐年增長及年輕化[1]。近年來,隨著醫(yī)療水平的進步,EC的治療取得巨大進步,但晚期患者易復發(fā)和轉移,預后較差[2]。目前,EC的發(fā)病機制尚未明確。因此,探討EC發(fā)生、發(fā)展的分子機制并尋找基因治療靶點對于EC的治療和預后改善具有重要意義。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類小分子非編碼RNA,通過與靶信使RNA(mRNA)的3'非翻譯區(qū)(3'untrans‐lated region,3'UTR)靶向結合,降解靶mRNA或抑制靶mRNA翻譯,進而調控靶基因的表達,影響細胞的生長、凋亡和分化等生命過程[3]。研究顯示,miR-128-3p參與調控肝癌、食管癌、乳腺癌等腫瘤細胞的增殖、凋亡和遷移,在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用[4-6]。但目前,miR-128-3p對EC細胞增殖和凋亡的影響還未知。生物信息學軟件預測顯示,Notch1的3'UTR存在與miR-128-3p結合的連續(xù)位點,提示Notch1是miR-128-3p的靶基因。Notch1是一種Ⅰ型跨膜蛋白,在腫瘤細胞生長、增殖和凋亡過程中起重要調控作用[7]。研究顯示,Notch1蛋白在EC組織中陽性表達率升高,其表達與患者腫瘤淋巴結轉移、分化程度等臨床病理特征密切相關,參與調控EC細胞的增殖和凋亡[8-9]。目前,miR-128-3p能否通過調控Notch1表達影響EC細胞的增殖和凋亡也還未知。本研究首先檢測了EC細胞系中miR-128-3p和Notch1表達水平,然后探討了過表達miR-128-3p或低表達Notch1對EC細胞增殖和凋亡及Wnt/β-catenin信號通路的影響,并驗證了miR-128-3p能否通過調控Notch1表達影響EC細胞增殖和凋亡,以期為EC的靶向分子治療提供新靶點。

        1 材料與方法

        1.1 材料 人子宮內膜血管內皮細胞hEEC、EC細胞系HEC-1A、Ishikawa和AN3CA(中國科學院上海細胞庫);胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、RP‐MI1640培養(yǎng)基(美國Hycolne公司);四甲基噻唑藍(methylthiazoletrazolium,MTT)、LipofectamineTM2000試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白檢測試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);胰蛋白酶(美國Sigma公司);Trizol試劑、逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒(深圳晶美生物工程有限公司);PCR引物(上海生工生物工程有限公司);兔抗人Notch1、細胞周期蛋白D1(cyclinD1)和活化的半胱天冬酶-3(cleaved-caspase-3)多克隆抗體(美國Abcam公司);兔抗人β-肌動蛋白(β-actin)多克隆抗體(Jackson公司),膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)細胞凋亡試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司);miR-128-3p模擬物(mimics)及陰性序列、miR-128-3p抑制劑及陰性序列、Notch1的小干擾RNA(si-Notch1)及亂序無意義陰性序列(si-NC,廣州銳博生物科技有限公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 細胞培養(yǎng) 子宮內膜血管內皮細胞hEEC、EC細胞系HEC-1A、Ishikawa和AN3CA均用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中(37℃、CO2體積分數5%、濕度97%)培養(yǎng)。每隔2 d更換1次新鮮的培養(yǎng)基。待細胞融合至80%~90%時,0.25%胰蛋白酶溶液消化,進行傳代培養(yǎng)。

        1.2.2 Ishikawa細胞轉染和分組 對數增殖期的Ishikawa細胞,以1×105個/孔接種于6孔板中。待細胞融合至60%時,按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書進行轉染。分別將miR-128-3p mimcs(miR-128-3p組)及陰性序列(miR-NC組)、miR-128-3p抑制劑(anti-miR-128-3p組)及陰性序列(anti-miR-NC組)、Notch1的小干擾RNA(si-Notch1)及亂序無意義陰性序列(si-NC)轉染至Ishikawa細胞。轉染12 h后,更換新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。收集細胞,RT-qPCR檢 測miR-128-3p或Western blot檢 測Notch1蛋白水平以評價轉染效果。

        1.2.3 RT-qPCR檢測細胞中miR-128-3p和Notch1 mRNA表達 Trizol試劑提取細胞中總RNA,并逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板,行PCR擴增。PCR擴增條件:95℃5 min,95℃10 s,60℃30 s,72℃30 s,共35個循環(huán)。miR-128-3p上游5'-GGAATTCAAC‐CAACTGTCAATAACTGGAG-3',下游5'-CGGGATC‐CAATTTGTCATCCAAATCTACTTTGG-3';Notch1上游5'-CGTGTGAACCCGTAGGCGCC-3',下游5'-GGCCAACGTGTGCAAGCGACGGC-3';U6上游5'-TGAACGCCGAGGGTGAGTGTCG-3',下 游5'-CGGAAC‐GTGACGTGTGGCGTACG-3';GAPDH上 游5'-GCGATAAGTGCTGAGCTGCTC-3',下游5'-GTTGACGC‐GAACTGACGTGT-3'。miR-128-3p以U6為內參,Notch1以GAPDH為內參,2?ΔΔCt法計算miR-128-3p和Notch1 mRNA的相對表達水平。

        1.2.4 MTT檢測Ishikawa細胞增殖 轉染后的各組Ishikawa細胞,以5×103個/孔細胞接種于96孔板中,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,每孔加入20 μl濃度為5 g/L的MTT,繼續(xù)孵育4 h。棄去培養(yǎng)基,每孔加入150 μl二甲基亞砜,反應5 min,混勻后于酶標儀490 nm處測定吸光度值(A)。每組設置3個復孔,實驗重復3次,取平均值。細胞存活率(%)=A實驗組/A對照組×100%。

        1.2.5 流式細胞儀檢測Ishikawa細胞凋亡 轉染后的各組Ishikawa細胞,以1×104個/孔細胞接種于24孔板中,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,胰蛋白酶消化,收集細胞。取1.0×106個細胞,加入適量預冷的PBS清洗細胞2次。參照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書,加入400 μl結合緩沖液,輕輕吹打混懸細胞。加入10 μl Annexin V-FITC,室溫避光孵育10 min。加入5 μl PI,室溫避光孵育5 min。最后再加入100 μl結合緩沖液,渦旋混勻后流式細胞儀檢測細胞凋亡。

        1.2.6 Western blot法檢測細胞中Notch1、cyclinD1和cleaved-caspase-3蛋白表達 RIPA蛋白裂解液提取細胞中總蛋白,4℃、12000 r/min離心5 min,保留上清液。BCA法測定上清中蛋白濃度對蛋白進行定量。取適量蛋白溶液,100℃煮沸5 min。蛋白變性后,以每孔20 μg蛋白行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結束后,濕轉至聚偏乙烯二氟膜,并置于5%脫脂牛奶中封閉2 h。分別加入稀釋后的Notch1(1∶500)、cyclinD1(1∶100)、cleaved-cas‐pase-3(1∶1000)和β-actin(1∶8000)抗體,4℃冰箱孵育過夜。洗膜后,加入辣根過氧化酶標記的二抗(1∶5000),室溫孵育1 h。洗膜后,滴加化學發(fā)光試劑ELC,避光顯影后使用ZF-258型凝膠成像系統(tǒng)(上海嘉鵬科技有限公司)曝光拍照,Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。目的蛋白的相對表達水平以期蛋白條帶灰度值與內參β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示。

        1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-128-3p與Notch1靶向關系 Starbase軟件預測顯示,Notch1的3'UTR含有與miR-128-3p結合的連續(xù)位點。采用PCR技術擴增含miR-128-3p結合位點的Notch1的3'UTR序列,將其克隆至psiCHECK-2質粒中,構建Notch1野生型載體(WT-Notch1)。利用基因定點突變技術將結合位點突變后,克隆至psiCHECK-2質粒,構建Notch1突變型載體(MUT-Notch1)。Ishi‐kawa細胞1×105個/孔接種于6孔板中。待細胞融合至60%時,分別共轉染WT-Notch1、MUT-Notch1與miR-128-3p mimic或miR-NC至Ishikawa細胞。轉染12 h后,收集細胞,檢測各組熒光素酶活性。具體操作參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書,各組的熒光素酶活性以熒光蟲活性與海腎熒光強度的比值表示。

        1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件對實驗數據進行分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗;多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        2.1 EC細胞系中miR-128-3p和Notch1表達水平與hEEC細胞比較,EC細胞系HEC-1A、Ishikawa和AN3CA中miR-128-3p表 達 水平 降低(P<0.05),Notch1 mRNA和蛋白表達水平升高(P<0.05)。見圖1和表1。

        圖1 Western blot檢測EC細胞系中Notch1蛋白表達Fig.1 Western blot detected expression of Notch1 protein in EC cell lines

        表1 EC細胞系中miR-128-3p和Notch1表達水平(±s,n=9)Tab.1 Expression levels of miR-128-3p and Notch1 pro?tein in EC cell lines(±s,n=9)

        Note:Compared with hEEC group,1)P<0.05.

        Groups hEEC HEC-1A Ishikawa AN3CA F P miR-128-3p 1.00±0.100.32±0.031)0.22±0.021)0.40±0.041)344.0930.000 Notch1 mRNA 1.02±0.113.02±0.301)3.76±0.381)2.76±0.281)149.1270.000 Notch1 protein 0.35±0.040.76±0.081)0.98±0.101)0.85±0.091)102.1150.000

        2.2 過表達miR-128-3p對Ishikawa細胞增殖和凋亡的影響 miR-128-3p組Ishikawa細胞中miR-128-3p水平高于miR-NC組(P<0.05),說明miR-128-3p mimics轉染成功,Ishikawa細胞中miR-128-3p過表達。與miR-NC組比較,miR-128-3p組Ishikawa細胞存活率和cyclinD1蛋白水平降低(P<0.05),細胞凋亡率和cleaved-caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)。見圖2和表2。

        圖2 高表達miR-128-3p對Ishikawa細胞增殖和凋亡的影響Fig.2 Effect of high expression of miR-128-3p on proliferation and apoptosis of Ishikawa cells

        表2 高表達miR-128-3p對Ishikawa細胞增殖和凋亡的影響(±s,n=9)Tab.2 Effect of high expression of miR-128-3p on proliferation and apoptosis of Ishikawa cells(±s,n=9)

        表2 高表達miR-128-3p對Ishikawa細胞增殖和凋亡的影響(±s,n=9)Tab.2 Effect of high expression of miR-128-3p on proliferation and apoptosis of Ishikawa cells(±s,n=9)

        Note:Compared with miR-NC group,1)P<0.05.

        Groups miR-NC miR-128-3p t P miR-128-3p 1.00±0.103.22±0.321)19.8650.000 CyclinD11.21±0.120.45±0.051)17.5380.000 Cleaved-caspase-30.36±0.040.88±0.091)15.8390.000 Cell viability(%)100.85±10.0861.24±6.121)10.0770.000 Apoptosis rate(%)6.43±0.6420.19±2.021)19.4810.000

        2.3 低表達Notch1對Ishikawa細胞增殖和凋亡的影響 si-Notch1組Ishikawa細胞中Notch1蛋白水平低于si-NC組(P<0.05),說明Notch1小干擾RNA轉染成功,Ishikawa細胞中Notch1表達降低。與si-NC組比較,si-Notch1組Ishikawa細胞存活率和cyclinD1蛋白水平降低(P<0.05),細胞凋亡率和cleaved-cas‐pase-3蛋白水平升高(P<0.05)。見圖3和表3。

        圖3 Western blot檢測Notch1、cyclinD1、cleaved-caspase-3蛋白表達Fig.3 Western blot detected expressions of Notch1,cy?clinD1 and cleaved-caspase-3 proteins

        表3 低表達Notch1對Ishikawa細胞增殖和凋亡的影響(±s,n=9)Tab.3 Effect of low expression of Notch1 on proliferation and apoptosis of Ishikawa cells(±s,n=9)

        表3 低表達Notch1對Ishikawa細胞增殖和凋亡的影響(±s,n=9)Tab.3 Effect of low expression of Notch1 on proliferation and apoptosis of Ishikawa cells(±s,n=9)

        Note:Compared with si-NC group,1)P<0.05.

        Groups si-NC si-Notch1 t P Notch10.96±0.100.35±0.041)16.9910.000 CyclinD11.18±0.120.40±0.041)18.4990.000 Cleaved-caspase-30.38±0.040.80±0.081)14.0870.000 Cell viability(%)100.76±10.0752.19±5.221)12.8460.000 Apoptosis rate(%)6.51±0.6522.37±2.241)20.4000.000

        2.4 miR-128-3p靶向調控Notch1表達 Starbase軟件預測顯示,Notch1的3'UTR含有與miR-128-3p結合的連續(xù)位點(圖4A)。雙熒光素酶活性檢測顯示,miR-128-3p mimics與WT-Notch1共轉染組熒光素酶活性低于miR-NC與WT-Notch1共轉染組(P<0.05),而miR-128-3p mimics與MUT-Notch1共轉染組與miR-NC與MUT-Notch1共轉染組相比熒光素酶活性無顯著性差異(P>0.05),說明miR-128-3p可與Notch1的3'UTR靶向結合。miR-128-3p組Notch1蛋白水平低于miR-NC組(P<0.05),anti-miR-128-3p組Notch1蛋白水平高于anti-miR-NC組(P<0.05),進一步說明miR-128-3p在Ishikawa細胞中靶向負調控Notch1表達。見圖4、表4、表5。

        圖4 miR-128-3p靶向調控Notch1表達Fig.4 miR-128-3p targeted regulation of Notch1 expres?sion

        表4 雙熒光素酶活性檢測結果(±s,n=9)Tab.4 Results of dual luciferase activity detection(±s,n=9)

        表4 雙熒光素酶活性檢測結果(±s,n=9)Tab.4 Results of dual luciferase activity detection(±s,n=9)

        Note:Compared with the miR-NC group,1)P<0.05.

        Groups miR-NC miR-128-3p t P Relative luciferase activity WT-Notch11.00±0.100.42±0.041)16.1550.000 MUT-Notch11.08±0.111.05±0.120.5530.588

        表5 miR-128-3p對Notch1蛋白表達的影響(±s,n=9)Tab.5 Effect of miR-128-3p on expression of Notch1 pro?tein(±s,n=9)

        表5 miR-128-3p對Notch1蛋白表達的影響(±s,n=9)Tab.5 Effect of miR-128-3p on expression of Notch1 pro?tein(±s,n=9)

        Note:Compared with miR-NC group,1)P<0.05;compared with antimiR-NC group,2)P<0.05.

        Groups miR-NC miR-128-3p anti-miR-NC anti-miR-128-3p F P Notch10.95±0.100.36±0.041)1.02±0.111.36±0.142)143.5770.000

        2.5 過表達Notch1可逆轉過表達miR-128-3p對Ishikawa細胞增殖和凋亡的影響 與miR-128-3p+pcDNA-NC組 比 較,miR-128-3p+pcDNA-Notch1組Ishikawa細胞存活率、Notch1和cyclinD1蛋白水平升高(P<0.05),細胞凋亡率和cleaved-caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)。見圖5和表6。

        圖5 Western blot檢測Notch1、cyclinD1、cleaved-caspase-3蛋白表達Fig.5 Western blot detected expressions of Notch1,cyclinD1 and cleared-caspase-3 proteins

        表6 過表達Notch1可逆轉過表達miR-128-3p對Ishikawa細胞增殖和凋亡的影響(±s,n=9)Tab.6 Overexpressing Notch1 reversed effect of overexpressing miR-128-3p on Ishikawa cell proliferation and apoptosis(±s,n=9)

        表6 過表達Notch1可逆轉過表達miR-128-3p對Ishikawa細胞增殖和凋亡的影響(±s,n=9)Tab.6 Overexpressing Notch1 reversed effect of overexpressing miR-128-3p on Ishikawa cell proliferation and apoptosis(±s,n=9)

        Note:Compared with miR-128-3p+pcDNA-NC group,1)P<0.05.

        Groups miR-128-3p+pcDNA-NC miR-128-3p+pcDNA-Notch1 t P Notch10.40±0.040.82±0.081)14.0870.000 CyclinD10.43±0.041.02±0.111)15.1220.000 Cleaved-caspase-30.89±0.090.48±0.051)11.9470.000 Cell viability(%)62.10±6.2190.01±9.011)7.6520.000 Apoptosis rate(%)20.28±2.0310.11±1.011)13.4560.000

        2.6 過表達Notch1可逆轉過表達miR-128-3p對Ishikawa細胞Wnt/β-catenin信號通路的影響 與miR-NC組比較,miR-128-3p組Ishikawa細胞β-catenin蛋白水平降低(P<0.05)。與miR-128-3p+pcDNANC組比較,miR-128-3p+pcDNA-Notch1組β-catenin蛋白水平升高(P<0.05)。見圖6和表7。

        表7 Western blot檢測β-catenin蛋白表達(±s,n=9)Tab.7 Western blot detected β-catenin protein expression(±s,n=9)

        表7 Western blot檢測β-catenin蛋白表達(±s,n=9)Tab.7 Western blot detected β-catenin protein expression(±s,n=9)

        Note:Compared with miR-NC group,1)P<0.05;compared with miR-128-3p+pcDNA-NC group,2)P<0.05.

        Groups miR-NC miR-128-3p miR-128-3p+pcDNA-NC miR-128-3p+pcDNA-Notch1 F P β-catenin 0.77±0.080.30±0.031)0.27±0.020.65±0.072)179.3100.000

        3 討論

        miRNA的長度約為18~25個核苷酸,在轉錄后調控靶基因的表達,影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。miR-128-3p是近年來新發(fā)現的一種miRNA。CHEN等[10]研究顯示,間變性甲狀腺癌細胞和組織中miR-128-3p表達水平降低,過表達miR-128-3p可降低癌細胞活力,并誘導細胞凋亡。FU等[11]研究顯示,miR-128-3p在膠質瘤組織中表達降低,過表達miR-128-3p通過靶向抑制gremlin1表達抑制膠質瘤細胞活性。ZHAO等[12]研究顯示,過表達miR-128-3p通過靶向抑制LIM結構域激酶1表達抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移能力。目前,還未見miR-128-3p影響EC細胞生物學行為的相關報道。

        本研究顯示,miR-128-3p在EC細胞系中表達降低,提示miR-128-3p作為促癌基因參與該疾病的發(fā)生發(fā)展。通過轉染miR-128-3p mimics構建過表達miR-128-3p的Ishikawa細胞,結果顯示,過表達miR-128-3p后,Ishikawa細胞存活率降低,凋亡率升高,提示過表達miR-128-3p抑制Ishikawa細胞增殖,促進細胞凋亡。cyclinD1是細胞周期調控蛋白,促進細胞由G1期向S期轉變,加速細胞增殖[13]。cas‐pase-3是caspase級聯反應的關鍵調控蛋白,其活化后促進細胞凋亡[14]。本研究顯示,過表達miR-128-3p可降低Ishikawa細胞中cyclinD1蛋白表達,促進活化的caspase-3蛋白表達,提示miR-128-3p通過調控cyclinD1和活化的caspase-3蛋白表達影響Ishikawa細胞的增殖和凋亡。為了進一步探討miR-128-3p影響EC細胞增殖和凋亡的作用機制,本研究生物信息學遇見預測顯示,Notch1可能是miR-128-3p的靶基因。本研究通過雙熒光素酶活性檢測證實了miR-128-3p可與Notch1的3'UTR靶向結合。此外,上調Ishikawa細胞中miR-128-3p表達后,Notch1蛋白表達降低,而下調miR-128-3p表達后,Notch1蛋白表達升高,進一步說明miR-128-3p靶向負調控Notch1表達。

        Notch1是Notch受體家族成員之一,在胰腺導管腺癌、非小細胞肺癌等腫瘤中發(fā)揮促癌作用[15-16]。本研究結果顯示,EC細胞系中Notch1 mRNA和蛋白表達升高,低表達Notch1可抑制EC細胞增殖,并誘導細胞凋亡,與相關研究結果一致,提示Notch1作為促癌基因參與EC發(fā)生發(fā)展,靶向抑制其表達對于該疾病的治療具有重要意義[9]。本研究還顯示,過表達Notch1逆轉了過表達miR-128-3p對Ishikawa細胞增殖和凋亡的影響,提示過表達miR-128-3p通過靶向抑制Notch1表達,進而抑制Ishikawa細胞增殖,并促進細胞凋亡。

        Wnt/β-catenin信號通路的激活可引起β-catenin轉位至細胞核,激活下游靶基因如cyclinD1、c-myc等表達,從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。如彭寧等[17]研究顯示,沉默肝癌細胞中ZNF674-AS1的表達可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路抑制肝癌細胞的增殖,并誘導細胞凋亡。研究已表明,抑制Wnt/βcatenin信號通路的激活可抑制EC細胞增殖、遷移和侵襲[18-19]。本研究結果顯示,過表達miR-128-3p可降低Ishikawa細胞中β-catenin和cyclinD1蛋白表達,而過表達Notch1逆轉了過表達miR-128-3p對Ishikawa細胞中β-catenin和cyclinD1蛋白表達的抑制作用,提示過表達miR-128-3p通過抑制Notch1表達,進而抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活影響Ishikawa細胞的增殖和凋亡。

        綜上所述,miR-128-3p在EC細胞中呈低表達,過表達miR-128-3p可抑制EC細胞增殖,并促進細胞凋亡,其可能通過靶向抑制Notch1表達及Wnt/βcatenin信號通路的激活發(fā)揮作用,是EC治療的潛在分子靶點。

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        STAT3對人肝內膽管癌細胞系增殖與凋亡的影響
        靶向超聲造影劑在冠心病中的應用
        抑制miR-31表達對胰腺癌Panc-1細胞系遷移和侵襲的影響及可能機制
        人多巴胺D2基因啟動子區(qū)—350A/G多態(tài)位點熒光素酶表達載體的構建與鑒定及活性檢測
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