吳美芬 潘海燕 劉裕曉 黃興麗 韋曉丹 武 革

（廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，湛江524001）

糖尿病是世界范圍內(nèi)的常見(jiàn)病，長(zhǎng)期易引發(fā)并發(fā)癥，危害患者健康，近年其發(fā)病率逐漸升高。1 型糖尿?。╰ype 1 diabetes mellitus，T1DM）是自身免疫介導(dǎo)引起胰島β 細(xì)胞破壞、凋亡增加的自身免疫性疾病，在糖尿病中所占比例低于T2DM，但其臨床癥狀較嚴(yán)重，多累及年輕人[1］。研究發(fā)現(xiàn)，T1DM 患者的高血糖往往與高血糖素血癥有關(guān)，而胰高血糖素由胰島α 細(xì)胞分泌[2］。胰高糖素樣肽1（glucagonlike peptide-1，GLP-1）是一種促胰島素肽，能促進(jìn)胰島β 細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，主要由腸道L 細(xì)胞分泌，近年被發(fā)現(xiàn)可通過(guò)胰島α 細(xì)胞合成胰高糖素原途徑產(chǎn)生[3-5］。二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）抑制劑是近年廣泛應(yīng)用于糖尿病治療的一類降糖藥物，通過(guò)抑制GLP-1降解及胰高糖素分泌，增加體內(nèi)胰島素分泌發(fā)揮降糖作用[6］。沙格列汀是DPP4 抑制劑的一種，既往多用于治療T2DM，臨床療效好，安全性高[7］。本研究將通過(guò)注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)建立T1DM 小鼠模型，研究沙格列汀對(duì)T1DM 小鼠GLP-1、胰高血糖素表達(dá)及胰島α 細(xì)胞增殖、凋亡的影響，以期為臨床治療T1DM提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康C57BL/6小鼠55只，8～10 周齡，體重25～30 g（南方模式生物研究中心），嚴(yán)格按照小鼠飼養(yǎng)規(guī)則進(jìn)行喂養(yǎng)，溫度為25℃，濕度為50%，光照時(shí)間為8：00～20：00，飲用蒸餾水，飼養(yǎng)期間保持飼養(yǎng)房間整潔、通風(fēng)，定時(shí)對(duì)鼠籠進(jìn)行清理。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》要求。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑與儀器 STZ 自行配制：枸櫞酸滴定生理鹽水至pH值為4.2，然后進(jìn)行高壓滅菌，臨用前以無(wú)菌酸化生理鹽水將STZ 配制成2% 工作液。胰島素（貨號(hào)：0215504401）購(gòu)自諾和公司；人GLP-1、人胰高血糖素ELISA 試劑盒、增殖細(xì)胞核抗原（pro‐liferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體、Ki-67 抗體、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體、GAPDH 抗體（貨號(hào)：ab41969、ab267567、ab92552、ab15580、ab32503、ab181602）購(gòu)自Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（貨號(hào)：0295G-HRP）購(gòu)自美國(guó)Santa 公司；TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：KFS197-SLG）購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；沙格列?。ㄘ浱?hào)：H20160088）購(gòu)自阿斯利康制藥有限公司；血糖儀（型號(hào)：HGM-114）購(gòu)自達(dá)而泰（天津）實(shí)業(yè)有限公司；酶標(biāo)儀（型號(hào)：MOD‐EL550）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（型號(hào)：ChemiDocXRS）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備 隨機(jī)抽取45 只小鼠造模，剩余10 只作為正常組。造模前小鼠禁食不禁水12 h，稱取空腹體重，按130 mg/kg STZ 給予小鼠單次腹腔注射。正常組小鼠同時(shí)間腹腔注射等量生理鹽水。結(jié)束注射藥物1 周后采集小鼠尾靜脈血，測(cè)小鼠禁食6 h后血糖。連續(xù)2次血糖≥11.1 mmol/L診斷為T1DM。 造模期間未連續(xù)2 次血糖≥11.1 mmol/L 者4 只，死亡1 只，造模成功的40 只小鼠繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥方法 造模成功的小鼠隨機(jī)分為模型組、胰島素組、沙格列汀低劑量組、沙格列汀高劑量組（10 只/組）。胰島素組皮下注射1 U胰島素；沙格列汀低、高劑量組分別灌胃1、3 mg/（kg·d）沙格列汀，正常組、模型組小鼠均灌胃等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)治療4周。

1.2.3 血糖儀檢測(cè)各組小鼠給藥前后血糖水平

造模后各組小鼠于給藥前、后禁食不禁水6 h 后采集尾靜脈血，血糖儀檢測(cè)血糖水平。

1.2.4 ELISA 法檢測(cè)各組小鼠GLP-1 和胰高血糖素水平 給藥結(jié)束后，麻醉小鼠進(jìn)行心臟采血，收集的血樣靜置3 h 分離血清。ELISA 法檢測(cè)小鼠血清GLP-1 和胰高血糖素水平，操作方法均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。使用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，波長(zhǎng)為450 nm，取3次重復(fù)平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液吸光度結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出換算方程，計(jì)算GLP-1和胰高血糖素水平。

1.2.5 免疫組化檢測(cè)各組小鼠胰島α 細(xì)胞增殖情況 取血后斷頸處死，立即分離出胰腺組織，以體積分?jǐn)?shù)0.9% 的冰生理鹽水沖洗，用濾紙吸干殘留水分。取近胰頭的1/2 置于4% 多聚甲醛溶液中固定，24 h 后常規(guī)脫水透明，石蠟包埋，切片。將石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，檸檬酸緩沖液修復(fù)抗原，滴加3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，10% 山羊血清室溫濕盒封閉，加入PCNA一抗（1∶6000）4℃孵育過(guò)夜，PBS 沖洗，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶5000）常溫孵育1 h，PBS 沖洗，DAB 顯色，水洗，蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。利用ImageProPlus 圖像分析系統(tǒng)采集圖像，每張片子取5個(gè)高倍視野（×400），計(jì)算增殖指數(shù)，增殖指數(shù)=增殖細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.6 TUNEL 法檢測(cè)各組小鼠胰島α 細(xì)胞凋亡情況 將石蠟切片脫蠟至水，檸檬酸緩沖液修復(fù)抗原，滴加3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加50 μl TUNEL 反應(yīng)液，置于濕盒中，37℃孵育1 h，PBS 沖洗，滴加3%H2O2反應(yīng)10 min，PBS溶液沖洗后，用含DAPI 的抗淬滅封片劑封片。利用ImageProPlus 圖像分析系統(tǒng)采集圖像，每張片子取5 個(gè)高倍視野（×400），計(jì)算凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.7 Western blot 檢測(cè)各組小鼠胰腺組織中Ki-67、Bax 蛋白表達(dá) RIPA 裂解液裂解胰腺組織，4℃離心后提取蛋白并定量，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后加入Ki-67、Bax、GAPDH 一抗（1∶500），4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶5000），室溫孵育1 h，免疫反應(yīng)化學(xué)發(fā)光法顯色，Tanon 600圖像分析系統(tǒng)拍攝圖像并分析條帶灰度，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)處理采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠給藥前后血糖水平 胰島素組、沙格列汀低、高劑量組給藥后血糖水平均顯著低于給藥前（P<0.05）。給藥前，與正常組相比，模型組小鼠血糖水平均顯著升高（P<0.05）；模型組、胰島素組、沙格列汀低、高劑量組小鼠血糖水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。給藥后，與對(duì)照組相比，模型組小鼠血糖水平均顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，胰島素組、沙格列汀低、高劑量組小鼠血糖水平均顯著降低（P<0.05）；胰島素組與沙格列汀低劑量組小鼠血糖水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與胰島素組、沙格列汀低劑量組相比，沙格列汀高劑量組小鼠血糖水平顯著降低（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠給藥前后血糖水平比較（±s，n=10，mmol/ L）Tab.1 Comparison of blood glucose levels before and af?ter administration（±s，n=10，mmol/ L）

表1 各組小鼠給藥前后血糖水平比較（±s，n=10，mmol/ L）Tab.1 Comparison of blood glucose levels before and af?ter administration（±s，n=10，mmol/ L）

Note：Compared with normal group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with insulin group，3）P<0.05；compared with low dose group of saxagliptin，4）P<0.05；com‐pared with before administration，5）P<0.05.

Groups Normal Model Insulin Saxagliptin low dose Saxagliptin high dose F P Before administration 5.46±0.8217.57±1.241）17.32±1.331）17.68±1.411）17.63±1.291）191.6680.000 After administration 5.73±0.8817.98±1.351）15.16±1.181）2）5）15.74±1.201）2）5）13.56±0.971）2）3）4）5）172.9350.000

2.2 各組小鼠血清GLP-1 和胰高血糖素水平 與正常組相比，模型組小鼠血清GLP-1水平顯著降低，胰高血糖素水平顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，胰島素組、沙格列汀低、高劑量組小鼠血清GLP-1水平顯著升高，胰高血糖素水平顯著降低（P<0.05）；胰島素組和沙格列汀低劑量組小鼠血清GLP-1、胰高血糖素水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與胰島素組、沙格列汀低劑量組相比，沙格列汀高劑量組小鼠血清GLP-1 水平顯著升高，胰高血糖素水平顯著降低（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血清GLP-1、胰高血糖素水平比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of serum GLP-1 and glucagon levels in each group（±s，n=10）

表2 各組小鼠血清GLP-1、胰高血糖素水平比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of serum GLP-1 and glucagon levels in each group（±s，n=10）

Note：Compared with normal group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with insulin group，3）P<0.05；com‐pared with saxagliptin low dose group，4）P<0.05.

Groups Normal Model Insulin Saxagliptin low dose Saxagliptin high dose F P GLP-1（mmol/ L）15.22±1.185.94±0.821）7.91±0.961）2）7.66±1.041）2）10.85±1.131）2）3）4）74.5480.000 Glucagon（pg/ ml）48.18±2.6466.84±2.851）59.59±2.881）2）62.02±2.951）2）54.68±2.731）2）3）4）38.6830.000

2.3 各組小鼠胰島α 細(xì)胞增殖情況 與正常組相比，模型組小鼠胰島α 細(xì)胞增殖指數(shù)顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，胰島素組、沙格列汀低、高劑量組小鼠胰島α 細(xì)胞增殖指數(shù)顯著降低（P<0.05）；胰島素組和沙格列汀低劑量組小鼠胰島α細(xì)胞增殖指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與胰島素組、沙格列汀低劑量組相比，沙格列汀高劑量組小鼠胰島α細(xì)胞增殖指數(shù)顯著降低（P<0.05）。見(jiàn)圖1、表3。

圖1 免疫組化檢測(cè)各組小鼠胰島α細(xì)胞增殖情況（×400）Fig.1 Proliferation of islet α cells was detected by immu?nohistochemistry（×400）

表3 各組小鼠胰島α細(xì)胞增殖指數(shù)比較（±s）Tab.3 Comparison of proliferation index of islet α cells in each group（±s）

表3 各組小鼠胰島α細(xì)胞增殖指數(shù)比較（±s）Tab.3 Comparison of proliferation index of islet α cells in each group（±s）

Note：Compared with normal group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with insulin group，3）P<0.05；com‐pared with the low dose group of saxagliptin，4）P<0.05.

Groups Normal Model Insulin Saxagliptin low dose Saxagliptin high dose FP n 1010101010? ?Proliferation index（%）24.87±1.3344.63±1.421）35.16±1.151）2）34.57±1.281）2）30.44±1.321）2）3）4）310.2340.000

2.4 各組小鼠胰島α 細(xì)胞凋亡情況 與正常組相比，模型組小鼠胰島α 細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，胰島素組、沙格列汀低、高劑量組小鼠胰島α 細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高（P<0.05）；胰島素組和沙格列汀低劑量組小鼠胰島α細(xì)胞凋亡指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與胰島素組、沙格列汀低劑量組相比，沙格列汀高劑量組小鼠胰島α細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高（P<0.05）。見(jiàn)圖2、表4。

圖2 TUNEL法檢測(cè)各組小鼠胰島α細(xì)胞凋亡情況（×400）Fig.2 Apoptosis of islet α cells was detected by TUNEL method（×400）

Note：Compared with normal group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with insulin group，3）P<0.05；com‐pared with low dose group of saxagliptin，4）P<0.05.

2.5 各組小鼠胰腺組織中Ki-67、Bax 蛋白表達(dá)情況 與正常組相比，模型組小鼠胰腺組織中Ki-67蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bax 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，胰島素組、沙格列汀低、高劑量組小鼠胰腺組織中Ki-67 蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）；胰島素組和沙格列汀低劑量組小鼠胰腺組織中Ki-67、Bax 蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與胰島素組、沙格列汀低劑量組相比，沙格列汀高劑量組小鼠胰腺組織中Ki-67 蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。見(jiàn)圖3、表5。

表5 各組小鼠胰腺組織中Ki-67、Bax 蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=10）Tab.5 Comparison of Ki-67 and Bax protein expression levels in pancreas of mice in each group（±s，n=10）

表5 各組小鼠胰腺組織中Ki-67、Bax 蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=10）Tab.5 Comparison of Ki-67 and Bax protein expression levels in pancreas of mice in each group（±s，n=10）

Note：Compared with normal group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with insulin group，3）P<0.05；com‐pared with low dose group of saxagliptin，4）P<0.05.

Groups Normal Model Insulin Saxagliptin low dose Saxagliptin high dose F P Ki-67/ GAPDH 0.24±0.040.93±0.151）0.62±0.131）2）0.69±0.121）2）0.44±0.081）2）3）4）54.8790.000 Bax/ GAPDH 0.88±0.140.35±0.051）0.49±0.061）2）0.46±0.061）2）0.67±0.071）2）3）4）63.2310.000

圖3 各組小鼠胰腺組織中Ki-67、Bax蛋白表達(dá)水情況Fig.3 Expressions of Ki-67 and Bax proteins in pancreas of mice in each group

3 討論

糖尿病是一種嚴(yán)重的非傳染性慢性疾病，是重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，分為T1DM、T2DM、妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）及特殊類型糖尿病4個(gè)類型。近年來(lái)，以兒童青少年為主的T1DM發(fā)病率逐年升高，在美國(guó)，T1DM 患者高達(dá)2500 多萬(wàn)人，相關(guān)治療費(fèi)用帶來(lái)的潛在社會(huì)、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)越來(lái)越重[8-11］。目前T1DM 的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，多認(rèn)為是胰島細(xì)胞受到自身免疫系統(tǒng)攻擊而減少或損傷，從而導(dǎo)致一系列不可逆的破壞[12］。既往研究治療對(duì)T1DM 胰島細(xì)胞的影響主要集中在胰島β細(xì)胞，針對(duì)胰島α 細(xì)胞的研究較少[13］。本研究通過(guò)研究沙格列汀對(duì)胰島α細(xì)胞增殖、凋亡的影響，以期為T1DM的臨床治療提供新思路。

本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠血糖水平較正常組顯著升高，沙格列汀低、高劑量組小鼠血糖水平較模型組顯著降低，提示沙格列汀可降低T1DM 小鼠血糖。GLP-1 是胰高血糖素原經(jīng)剪切后的產(chǎn)物，作用于胰島β 細(xì)胞可促進(jìn)胰島素的轉(zhuǎn)錄、合成與分泌，刺激胰島β細(xì)胞的增殖和分化并抑制其凋亡，從而增加胰島β 細(xì)胞數(shù)量[14-15］。胰高血糖素可促進(jìn)血糖升高，正常情況下與胰島素相互拮抗共同維持血糖穩(wěn)定，胰高血糖素拮抗劑在臨床應(yīng)用中可有效維持血糖穩(wěn)態(tài)、改善β細(xì)胞功能，延緩甚至逆轉(zhuǎn)糖尿病病程[16］。王進(jìn)紅等[17］研究發(fā)現(xiàn)，沙格列汀可通過(guò)阻斷GLP-1 降解調(diào)節(jié)胰島素分泌，加強(qiáng)機(jī)體對(duì)葡萄糖的利用及對(duì)血糖水平的控制。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠血清GLP-1水平顯著降低，胰高血糖素水平顯著升高；與模型組相比，胰島素組、沙格列汀低、高劑量組小鼠血清GLP-1水平顯著升高，胰高血糖素水平顯著降低，提示T1DM 的發(fā)生與GLP-1、胰高血糖素水平有關(guān)，沙格列汀治療T1DM 可能通過(guò)影響GLP-1、胰高血糖素實(shí)現(xiàn)，與胰島素作用效果一致，且高劑量沙格列汀治療效果優(yōu)于胰島素。

胰島α 細(xì)胞可通過(guò)分泌GLP-1 進(jìn)而影響胰島α細(xì)胞的增殖及功能，也可通過(guò)分泌胰高血糖素加速糖尿病進(jìn)展[18-19］。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠胰島α 細(xì)胞增殖指數(shù)顯著升高，凋亡指數(shù)顯著降低；與模型組相比，胰島素組、沙格列汀低、高劑量組小鼠胰島α細(xì)胞增殖指數(shù)顯著降低，凋亡指數(shù)顯著升高。Ki-67、Bax分別與細(xì)胞增殖、凋亡有關(guān)[20］。與正常組相比，模型組小鼠胰島α 細(xì)胞中Ki-67 蛋白水平顯著升高，Bax 蛋白水平顯著降低；與模型組相比，胰島素組、沙格列汀低劑量組、沙格列汀高劑量組小鼠胰島α 細(xì)胞中Ki-67 蛋白水平顯著降低，Bax 蛋白水平顯著升高，提示T1DM 可導(dǎo)致小鼠胰島α 細(xì)胞增殖、凋亡異常，沙格列汀、胰島素均可通過(guò)抑制T1DM 小鼠胰島α 細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，推測(cè)沙格列汀可能通過(guò)影響胰島α細(xì)胞增殖、凋亡進(jìn)而影響GLP-1、胰高血糖素分泌，最終導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能恢復(fù)正常，達(dá)到治療T1DM的目的。

綜上所述，沙格列汀可降低T1DM 小鼠血糖水平，可能是通過(guò)促進(jìn)胰島α細(xì)胞凋亡并抑制其增殖，進(jìn)而促進(jìn)血清GLP-1 表達(dá)，并抑制胰高血糖素表達(dá)發(fā)揮作用的。