田少輝 張學(xué)浩 徐江龍 喬曉霞 張雨豪

（河北大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，保定071000）

腦膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，雖然發(fā)病率較低，但惡性程度較高，嚴(yán)重威脅人類健康[1］。腦膠質(zhì)瘤具有惡性程度高、擴展性生長并向周圍組織浸潤的特點，臨床常采用手術(shù)、放化療治療，但均無法徹底清除腫瘤組織，導(dǎo)致患者免疫功能低下甚至復(fù)發(fā)，致殘率和致死率較高。因此，尋找有效且不良反應(yīng)較小的藥物及治療方法至關(guān)重要。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼單鏈小分子RNA，長度19～25個核苷酸，通過與靶基因miRNA 的3'非翻譯區(qū)結(jié)合調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后表達，參與調(diào)節(jié)細胞的生理和病理過程，包括細胞增殖、分化、凋亡及激素生物合成和分泌[2-3］。研究證實，miR-194 參與調(diào)控非小細胞肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌等細胞增殖與遷移，但其在腦膠質(zhì)瘤中的研究較少[4-6］。

Bmi-1（B-lymphoma moloney murine leukemia vi‐rus insertion region-1）屬于多梳蛋白家族，在干細胞自我更新、細胞增殖、周期調(diào)控和抗凋亡調(diào)節(jié)等方面具有重要作用。Bmi-1 在多種癌癥中表達上調(diào)，因此被認為是癌基因，包括在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中[7-9］。PI3K/Akt 途徑在各種生物學(xué)過程中均具有重要功能，且PI3K 信號傳導(dǎo)異常對多種疾病均有影響，包括糖尿病、帕金森病、癌癥等[10-12］。研究發(fā)現(xiàn)，Bmi-1通過激活PI3K/AKT 信號途徑促進胰腺癌干細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[13］，但Bmi-1 介導(dǎo)PI3K/Akt 信號途徑對膠質(zhì)瘤細胞的研究較少。因此，本研究探討miR-194通過靶向Bmi-1調(diào)控PI3K/Akt信號通路對腦膠質(zhì)瘤細胞遷移和凋亡的影響，為腦膠質(zhì)瘤臨床治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本 所有腦膠質(zhì)瘤組織（30 例）和相應(yīng)的癌旁非腫瘤組織（30 例）均來自我院接受腦膠質(zhì)瘤切除手術(shù)的患者。所有患者手術(shù)前接受化學(xué)治療，術(shù)后進行病理診斷。所有患者知情同意，所有實驗經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)與監(jiān)督。各組織標(biāo)本保存于液氮中直至使用。

1.1.2 細胞 正常星形膠質(zhì)HA1800 細胞株、腦膠質(zhì)瘤細胞株（U251、U87、LN229）購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所。

1.1.3 試劑 DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco 公司；TRIzol 試劑、PrimeScriptTMRT Reagen Kit試劑盒、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis 試劑盒和SYBR?Premix EX TaqTMⅡ試劑盒購自日本Ta‐KaRa 公司；NC mimics、miR-194 mimics、NC inhibi‐tor、miR-194 inhibitor、pcDNA/NC、pcDNA/Bmi-1、si-NC 和si-Bmi-1購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Li‐pofectamineTM3000 購自美國Invitrogen 公司；免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；pmir‐GLO 載體、雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自美國promega 公司；Annexin V-FITC/PI 試劑盒、RIPA 裂解液和BCA 試劑盒購自美國Abcam 公司；T 兔抗Bmi-1 抗體、兔抗p-PI3K 抗體、兔抗PI3K 抗體、兔抗p-Akt 抗體、兔抗Akt 抗體、兔抗β-actin 和山羊抗兔IgG購自美國Cell Signaling Technology 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HA1800 細胞、U251 細胞、U87細胞和LN229 細胞采用含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃、5%CO2，0.25% 胰蛋白酶消化傳代，2 d更換1次培養(yǎng)基，以保證細胞所需營養(yǎng)成分。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 按照LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑說明書將NC mimics、miR-194 mimics、NC in‐hibitor、miR-145 inhibitor 分別轉(zhuǎn)入U251 細胞，轉(zhuǎn)染終濃度為100 nmol/L；將pcDNA/NC、pcDNA/Bmi-1、si-NC、si-Bmi-1 分別轉(zhuǎn)入U251 細胞，轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmol/L；37℃、5%CO2培養(yǎng)6 h，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集各組細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.3 qRT-PCR 采用TRIzol 試劑提取組織樣本或細胞總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA純度和含量，將各配對樣品調(diào)節(jié)至相同濃度。采用Prime‐ScriptTMRT Reagen Kit 試劑盒將提取的RNA（miR‐NA）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis 試劑盒將提取的RNA（mRNA）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR Premix EX TaqTMⅡ試劑盒進行qRT-PCR，F(xiàn)TC-3000p 實時PCR 系統(tǒng)完成實驗，2?ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 Transwell遷移實驗 收集各組轉(zhuǎn)染48 h細胞，胰酶消化，制成單細胞懸液，細胞密度為1×106個/ml。Transwell 小室上室加入細胞懸液100 μl，下室加入含10%FBS 的完全培養(yǎng)基500 μl，37℃、5%CO2、飽和濕度孵育8 h，取出聚碳酸酯微孔膜，中性甲醛固定，蘇木素染色，顯微鏡下隨機選取5個視野，統(tǒng)計穿膜細胞數(shù)，以穿膜細胞數(shù)表示細胞侵襲能力。

1.2.5 流式細胞術(shù) 收集各組轉(zhuǎn)染48 h 細胞，離心，重懸于緩沖液，依次加入Annexin V-FITC 溶液（10 μl）和PI 溶液（10 μl）染色，室溫下黑暗孵育30 min，F(xiàn)ACS CaliburTM流式細胞儀分析。

1.2.6 免疫組織化學(xué)染色 組織于4% 多聚甲醛固定，包埋，制5 μm切片，脫蠟至水，3%過氧化氫溶液去除內(nèi)源性過氧化物酶，3% 牛血清白蛋白封閉30 min。滴加一抗（Bmi-1 抗體）4℃孵育過夜，滴加二抗（HRP 標(biāo)記的山羊抗兔）室溫孵育1 h。DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照，目標(biāo)蛋白呈棕黃色則為陽性表達。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因 將預(yù)測得到含miR-914 結(jié)合位點的Bmi-13'UTR 片段插入pmirGLO，得到野生型Bmi-13'UTR 的報告基因載體Bmi-13'UTR wt。將靶序列進行突變得到突變型載體Bmi-13'UTR mut。 Bmi-13'UTR wt、Bmi-13'UTR mut 與miR-194 mimics 或NC mimics 共轉(zhuǎn)染至U251 細胞，48 h 后雙熒光素酶活性檢測試劑盒測定U251 細胞熒光素酶活性。

1.2.9 Western blot RIPA 裂 解 液 提 取U251 細 胞總蛋白，BCA 法測定總蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5% 脫脂奶室溫封閉1 h，加 入p-PI3K 抗 體（1∶1000）、PI3K 抗 體（1∶1000）、p-Akt 抗體（1∶1000）、Akt 抗體（1∶1000）、β-catin 抗體（1∶2000）4℃孵育過夜。TBST 洗滌3 次，持續(xù)5 min，加入山羊抗兔IgG-HRP（1∶5000）孵育1 h，TBST 洗滌3 次，持續(xù)5 min。顯影曝光，Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，率的比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-194 在腦膠質(zhì)瘤組織和腦膠質(zhì)瘤細胞中的表達 qRT-PCR 結(jié)果表明，與癌旁非腫瘤組織組相比，miR-194 在腫瘤組織中表達明顯下調(diào)（P<0.01，圖1A）；與HA1800 細胞相比，3 個腦膠質(zhì)瘤細胞中均觀察到miR-194 呈低表達（P<0.05），其中，U251細胞中miR-194表達最低（P<0.001，圖1B），因此，選擇U251細胞進行后續(xù)實驗。

圖1 miR-194在腦膠質(zhì)瘤組織和腦膠質(zhì)瘤細胞中的表達Fig.1 miR-194 expressions in glioma tissues and glioma cells

2.2 miR-194 對U251 細胞遷移能力的影響 Tran‐swell 遷移實驗結(jié)果表明，與NC mimics 組相比，miR-194 mimics 組U251 細胞遷移數(shù)顯著減少（P<0.001）；與NC inhibitor 組相比，miR-194 inhibitor 組U251細胞遷移數(shù)明顯增加（P<0.01，圖2）。

圖2 miR-194對U251細胞遷移能力的影響（×200）Fig.2 Effect of miR-194 on migration ability of U251 cells（×200）

2.3 miR-194 對U251 細胞凋亡率的影響 流式細胞術(shù)結(jié)果表明，與NC mimics組相比，miR-194 mimics組U251 細胞凋亡率上升（P<0.05）；與NC inhibitor組相比，miR-194 inhibitor 組U251 細胞凋亡率下降（P<0.05，圖3）。

Note：*.P<0.05.

2.4 Bmi-1 在腦膠質(zhì)瘤組織和腦膠質(zhì)瘤細胞中的表達 免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，與癌旁非腫瘤組織相比，Bmi-1在腫瘤組織中陽性表達率明顯上調(diào)（P<0.01 ，圖4A）；qRT-PCR結(jié)果表明，與HA1800細胞相比，U251細胞中Bmi-1表達明顯上調(diào)（P<0.01，圖4B）。

圖4 Bmi-1在腦膠質(zhì)瘤組織和腦膠質(zhì)瘤細胞中的表達（×400）Fig.4 Bmi-1 expressions in glioma tissues and glioma cells（×400）

2.5 Bmi-1 是miR-194 的 靶 基 因 TargetScan 數(shù) 據(jù)庫分析結(jié)果顯示，Bmi-1 是miR-194 的候選目標(biāo)（圖5A）。雙熒光素酶報告基因測定結(jié)果表明，miR-194 mimics 明顯抑制攜帶Bmi-13'UTR wt 的熒光素酶活性（P<0.001，圖5B），但報告質(zhì)粒攜帶Bmi-13'UTR mut 時未觀察到明顯抑制作用（P>0.05）。

圖5 Bmi-1與miR-194的靶相關(guān)系Fig.5 Targeting relationship between Bmi-1 and miR-194

2.6 miR-194與Bmi-1呈負調(diào)控 qRT-PCR 結(jié)果表明，與NC mimics組相比，miR-194 mimics組中Bmi-1表達明顯下調(diào)（P<0.01），與NC inhibitor 組相比，miR-194 inhibitor 組中Bmi-1 表達明顯上調(diào)（P<0.01）；與PCDNA/NC 組相比，pcDNA/Bmi-1 組中miR-194表達顯著下調(diào)（P<0.001），與si-NC 組相比，si-Bmi-1組中miR-194表達明顯上調(diào)（P<0.01，圖6）。

圖6 miR-194與Bmi-1呈負調(diào)控Fig.6 miR-194 and Bmi-1 had a negative regulatory rela?tionship

2.7 miR-194 靶向Bmi-1 對U251 細胞遷移能力的影響 Transwell 遷移實驗結(jié)果表明，與pcDNA/Bmi-1+NC mimics 組 相 比，pcDNA/Bmi-1+miR-194 mimics 組U251 細胞遷移數(shù)明顯減少（P<0.01）；與si-Bmi-1+NC inhibitor 組相比，si-Bmi-1+miR-194 in‐hibitor組U251細胞遷移數(shù)明顯增加（P<0.01，圖7）。

圖7 miR-194 靶向Bmi-1 對U251 細胞遷移能力的影響（×200）Fig.7 Effect of miR-194 targeting Bmi-1 on migrationability of U251 cells（×200）

2.8 miR-194 靶向Bmi-1 對U251 細胞凋亡率的影響 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與pcDNA/Bmi-1+NC mimics 組 相 比，pcDNA/Bmi-1+miR-194 mimics 組U251 細胞凋亡率顯著提高（P<0.001）；與si-Bmi-1+NC inhibitor 組 相 比，si-Bmi-1+miR-194 inhibitor 組U251細胞凋亡率顯著下降（P<0.001，圖8）。

圖8 miR-194靶向Bmi-1對U251細胞凋亡率的影響Fig.8 Effect of miR-194 targeting Bmi-1 on apoptosis rate of U251 cells

2.9 miR-194 靶向Bmi-1 對PI3K/Akt 通路相關(guān)蛋白的影響 Western blot結(jié)果表明，與pcDNA/Bmi-1+NC mimics 組相 比，pcDNA/Bmi-1+miR-194 mimics組中PI3K 蛋白磷酸化程度和Akt 蛋白磷酸化程度明顯降低（P<0.01）；與si-Bmi-1+NC inhibitor 組相比，si-Bmi-1+miR-194 inhibitor 組中PI3K 蛋白磷酸化程度和Akt 蛋白磷酸化程度明顯增強（P<0.001，P<0.01，圖9）。

圖9 miR-194靶向Bmi-1對PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白的影響Fig.9 Effect of miR-194 targeting Bmi-1 on PI3K/Akt pathway-related proteins

3 討論

腦膠質(zhì)瘤占顱內(nèi)惡性腫瘤的40%～60%，手術(shù)治療生存期僅為12～18 個月[14］。目前膠質(zhì)瘤臨床常規(guī)治療手段包括手術(shù)、放化療等，療效均已取得極大改善，但多數(shù)患者術(shù)后生存率仍未得到明顯改善[15］。近年分子生物學(xué)發(fā)展對腫瘤基因診斷和治療具有極大促進作用，但針對腦膠質(zhì)瘤的分子靶向藥物治療尚未在臨床得到廣泛應(yīng)用。尋找并鑒定具有抑制腦膠質(zhì)瘤細胞增殖的小分子將為腦膠質(zhì)瘤診治提供新靶點。

miR-194 是miRNA 家族成員，可抑制多種腫瘤生長、分化、侵襲、遷移及凋亡。研究顯示，miR-194在多種惡性腫瘤中異常表達，參與其分化、增殖和凋亡過程。如miR-194通過靶向NFAT5抑制高糖誘導(dǎo)的非小細胞肺癌細胞進程[16］；miR-194 通過抑制RAP2B 抑制膀胱癌細胞增殖和侵襲[17］。本研究表明，miR-194 在腦膠質(zhì)瘤組織和腦膠質(zhì)瘤細胞中呈低表達，且過表達miR-194 抑制U251 細胞遷移、促進其凋亡。

Bmi-1 基因是PcG 家族核心成員之一，對胚胎期哺乳動物骨骼、造血及神經(jīng)發(fā)育發(fā)揮重要作用。腫瘤細胞中，Bmi-1 呈高表達，促進腫瘤細胞不斷更新為癌癥干細胞，其表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、預(yù)后等病理指標(biāo)相關(guān)[18-19］。本研究發(fā)現(xiàn)，Bmi-1在腦膠質(zhì)瘤組織和腦膠質(zhì)瘤細胞中呈高表達，過表達Bmi-1 導(dǎo)致U251 細胞遷移能力增加，凋亡率下降；且過表達miR-194 可逆轉(zhuǎn)Bmi-1 過表達引起的U251細胞遷移能力增強，凋亡率下降。

PI3K/Akt 信號通路在腦膠質(zhì)瘤細胞中過度活化，促進腦膠質(zhì)瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移等[20］。本研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt 通路在Bmi-1過表達的腦膠質(zhì)瘤細胞中被激活，且過表達miR-194可抑制PI3K/Akt通路激活。

綜上所述，本研究驗證了miR-194與Bmi-1的相互作用關(guān)系，過表達miR-194 抑制Bmi-1 表達，使PI3K 和Akt 蛋白磷酸化程度降低，從而抑制腦膠質(zhì)瘤細胞遷移，促進其凋亡。因此，miR-194 有望成為腦膠質(zhì)瘤治療靶點。