支小飛 陳思俊 華如衡 朱建偉（南通大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，南通226001）

胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是來源于胃腸道間充質(zhì)干細(xì)胞最常見的間葉源性腫瘤，在消化道腫瘤中約占1%~3%，其主要在胃及小腸中發(fā)生［1-2］?？砂l(fā)生于各年齡段，絕大多數(shù)病例發(fā)生于成年人，但在兒童中也有報(bào)道，且多為惡性，男女GIST發(fā)病率沒有明顯差異［3-4］。microRNA是一種廣泛分布的內(nèi)源性非編碼蛋白質(zhì)的小RNAs（約為22個(gè)核苷酸），其特點(diǎn)是可以結(jié)合到mRNA的3'UTR端來發(fā)揮其負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的作用［5］?，F(xiàn)已證實(shí)，miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有緊密的聯(lián)系［6］。

研究顯示，miRNA在胃腸道間質(zhì)瘤中同樣存在著差異表達(dá)，多種miRNA參與胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡等過程，表明miRNA在胃腸道間質(zhì)瘤形成發(fā)展中扮演著重要角色［7-10］。miR-124也是被認(rèn)可的miRNA家族中的成員之一，已有研究表明，miR-124在腫瘤性疾病、神經(jīng)發(fā)生中表達(dá)有明顯異常，扮演著重要的調(diào)控角色［11-15］。但目前有關(guān)miR-124在胃腸道間質(zhì)瘤中的表達(dá)情況及調(diào)控作用研究相當(dāng)少，其具體作用機(jī)制仍然是不清楚的。本研究中通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了miR-124在胃腸道間質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)，并且進(jìn)一步探討了miR-124對(duì)于GIST-T1細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡的影響以及相關(guān)的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 主要試劑細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶購自Sigma；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑和Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自Invit‐rogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒購自Promega公司；Capn4-3'UTR和Capn4-3'UTR MUT由擎科生物有限公司設(shè)計(jì)；miR-124 mimics及NC-mimics、miR-124 inhibitor及NC-in‐hibitor由上海吉瑪制藥公司設(shè)計(jì)并合成；CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物有限公司；Transwell孔板購自康寧；Capn4（ab93959，兔抗）購自Abcam；β-actin抗體（AA128，鼠抗）購自上海碧云天生物有限公司；胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系（GIST-T1），貨號(hào)為QCB318購自上海欽誠生物科技有限公司。

1.1.2 臨床樣本選取來自南通大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科實(shí)施外科手術(shù)切除，符合中國胃腸道間質(zhì)瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)的GIST臨床病例30例，依據(jù)生長部位分為：胃16例、腸道10例、胃腸外4例；依據(jù)腫瘤直徑分為：直徑≤2 cm 3例，直徑2.1~5.0 cm 10例，直徑5.1~10.0 cm 13例，直徑>10 cm 4例；根據(jù)GIST危險(xiǎn)度分級(jí)分為：極低度危險(xiǎn)性腫瘤3例，低度危險(xiǎn)性腫瘤8例，中度危險(xiǎn)性腫瘤12例，高度危險(xiǎn)性腫瘤7例。其中男性17例，女性13例，患者年齡分布在17~58歲，平均年齡（45±10）歲，手術(shù)切除標(biāo)本具有保存完整的腫瘤組織和切緣正常組織，分別選取腫瘤組織及切緣組織標(biāo)本各30例，組織離體后液氮中進(jìn)行凍存，并在使用前均經(jīng)HE染色和免疫組化標(biāo)記（CD117、CD34、SMA、Desmin4）進(jìn)行鑒定。

1.2 方法

1.2.1 GIST-T1細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞轉(zhuǎn)染人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞系（GIST-T1）使用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，每3 d進(jìn)行1次換液。收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中，2×105個(gè)/孔。采用Lipofectamine 2000試劑根據(jù)說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行模擬物mimics和inhibitor處理，模擬物處理的細(xì)胞分為3組：空白對(duì)照組（NC組）、陰性對(duì)照組（mimics-NC組）和miR-124模擬物組（miR-124 mimics組）。In‐hibitor處理的細(xì)胞分為3組：空白對(duì)照組（NC組）、陰性對(duì)照組（inhibitor-NC組）和miR-124抑制劑組（miR-124 inhibitor組）。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR根據(jù)TRIzol Reagent使用說明書提取組織及細(xì)胞中的總RNA。取100 ng的總RNA為模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書獲得cDNA。取cDNA和引物，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒說明書配制PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)（95℃5 s，60℃20 s）。U6為miR-124的內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-124的 相 對(duì) 表 達(dá)。miR-124 F：5'-GAGAATTCGCACGCGTCGCCAGCTTTTTC-3'，miR-124 R：5'-TCTCTAGATGCAGCTGCAGCGCTGAGATC-3'；U6 F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3'，U6 R：5'-CGAATTTGCGTGTCATCCT-3'。

1.2.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖使用96孔板按照上述方法轉(zhuǎn)染GIST-T1細(xì)胞，并在標(biāo)準(zhǔn)空白孔中加入不含細(xì)胞的完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后在每個(gè)孔中加入10 μl CCK-8試劑，于搖床上輕輕晃動(dòng)混勻后，置于37℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)1 h，然后使用酶標(biāo)儀測(cè)定波長450 nm的吸光度值。

1.2.4 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲遷移：轉(zhuǎn)染24 h后用胰酶消化各組細(xì)胞并使用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×108個(gè)/L，取細(xì)胞懸液100 μl加在Transwell小室的上層，Transwell小室下層加入500 μl含10%血清培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出小室，PBS清洗后使用棉簽輕輕擦去上室中未遷移的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20 min，PBS清 洗3次 后 使 用0.1%結(jié) 晶 紫 染 色10 min，PBS清洗后隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)下室染色細(xì)胞。侵襲：將凍存的Matrigel置于4℃冰箱直至液態(tài)，用400 μl無血清培養(yǎng)基稀釋50 μl Matrigel膠原液并混勻。向Transwell小室上室中加50 μl上述稀釋液，置于37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育直到凝固，然后加入100 μl無血清培養(yǎng)基浸潤凝膠，吸棄，后續(xù)步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。通過計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞的數(shù)目來反映細(xì)胞侵襲能力。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)染48 h后用不含EDTA的胰酶消化miR-124 mimics組、mimics-NC組、空白對(duì)照組細(xì)胞，用上清培養(yǎng)液終止消化，1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，使用500 μl 1×binding buffer重懸細(xì)胞，然后加入5 μl Annexin VFITC和10 μl PI，室溫避光5 min后流式細(xì)胞術(shù)統(tǒng)計(jì)各組的凋亡率。

1.2.6 通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-124的靶基因通過生物信息學(xué)網(wǎng)站miRBD和Target Scan聯(lián)合預(yù)測(cè)miR-124的靶基因。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)取GIST-T1細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，按照Lipo‐fectamine 2000試劑說明書進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，然后將細(xì)胞分為以下4組：①野生型質(zhì)粒對(duì)照組（轉(zhuǎn)染mimics-NC和Capn4-3'UTR）；②野生型實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染miR-124 mimics和Capn4-3'UTR）；③突變型質(zhì)粒對(duì)照組（轉(zhuǎn)染mimics-NC和Capn4-3'UTR MUT）；④突變型質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染miR-124 mimics和Capn4-3'UTR MUT）。24 h后裂解細(xì)胞，并按照雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)熒光素酶活性。相對(duì)熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.2.8 Western blot檢測(cè)收集轉(zhuǎn)染后的GIST-T1細(xì)胞，進(jìn)行裂解后提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，BCA法測(cè)定蛋白濃度。每孔上樣量為20 μg，10%SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)跑膠，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，用1×PBST溶液清洗3次，然后加入一抗（Capn4抗體、β-actin抗體），4℃過夜孵育，洗膜后加入二抗，室溫孵育2 h，洗膜后加入ECL顯影液顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GRAPD prism 6統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組數(shù)據(jù)之間的比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組數(shù)據(jù)之間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-124在胃腸道間質(zhì)瘤組織中具有低表達(dá)qRT-PCR檢測(cè)收集到的30例胃腸道間質(zhì)瘤組織、癌旁組織中miR-124的表達(dá)情況，以U6作為內(nèi)參，結(jié)果顯示miR-124在胃腸道間質(zhì)瘤組織中的表達(dá)量顯著低于癌旁組織（P<0.01，圖1）。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)miR-124在GIST組織、癌旁組織中的差異性表達(dá)Fig.1 Differential expression of miR-124 in GIST tissues and adjacent tissues by qRT-PCR

2.2 miR-124在GIST-T1細(xì)胞中過表達(dá)后檢測(cè)及細(xì)胞生物學(xué)功能檢測(cè)以胃腸道間質(zhì)瘤（GIST-T1）細(xì)胞作為研究對(duì)象，在細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-124 mimics、mimics-NC、miR-124 inhibitor、inhibitor-NC 48 h后，如圖2A所示，與mimics-NC組相比，miR-124 mimics組GIST-T1細(xì)胞中的miR-124表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.01），mimics-NC組與空白對(duì)照組之間并沒有差異，而與inhibitor-NC組相比，miR-124 inhibi‐tor組GIST-T1細(xì)胞中的miR-124表達(dá)顯著下降（P<0.001）。提示轉(zhuǎn)染miR-124 mimics能明顯提高細(xì)胞中miR-124的表達(dá)水平，轉(zhuǎn)染效率高。

在細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-124 mimics和mimics-NC 48 h后，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（如圖2B），與mim‐ics-NC組相比較，miR-124 mimics組細(xì)胞吸光度值明顯低于mimics-NC組（P<0.01），而mimics-NC組與空白對(duì)照組之間并無差異，說明上調(diào)miR-124表達(dá)能顯著降低GIST-T1細(xì)胞增殖。

在細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-124 mimics和mimics-NC 48 h后，Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（如圖2C），與mimics-NC組 相比 較，miR-124 mimics組GIST-T1細(xì)胞遷移數(shù)目明顯減少（P<0.01），mimics-NC組與空白對(duì)照組之間并無差異。說明上調(diào)miR-124表達(dá)能明顯抑制GIST-T1細(xì)胞遷移。此外，Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲，顯示侵襲能力下降（如圖2D，P<0.05）。

在細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-124 mimics和mimics-NC 48 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果如圖2E所示，與mimics-NC組相比較，miR-124 mimics組GIST-T1細(xì)胞的總凋亡率明顯增加（P<0.001），mimics-NC組與空白對(duì)照組之間并無差異。結(jié)果說明上調(diào)miR-124表達(dá)能明顯促進(jìn)GIST-T1細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖2 miR-124表達(dá)對(duì)GIST-T1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡能力的影響Fig.2 Effect of miR-124 expression on proliferation，mi?gration，invasion and apoptosis of GIST-T1 cells

2.3 miR-124的靶基因預(yù)測(cè)通過生物信息學(xué)在線分析網(wǎng)站miRanda及Targetscan進(jìn)行聯(lián)合預(yù)測(cè)，并結(jié)合參考文獻(xiàn)［16］，預(yù)測(cè)Capn4可能是miR-124的靶基因，miR-124與Capn4 3'UTR區(qū)存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)（如圖3A）。進(jìn)一步通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-124與Capn4 3'UTR的結(jié)合作用（如圖3B），結(jié)果顯示，miR-124能夠顯著性抑制GIST-T1細(xì)胞中Capn4 3'UTR區(qū)的熒光素酶活性（P<0.01），而miR-124對(duì)GIST-T1細(xì)胞中Capn4 3'UTR突變區(qū)的熒光素酶活性沒有明顯的抑制作用。說明miR-124可以與Capn4 3'UTR區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合。

圖3 miR-124與Capn4靶向結(jié)合Fig.3 Targeted binding of miR-124 to Capn4

2.4 miR-124對(duì)Capn4基因的表達(dá)調(diào)控細(xì)胞分組同上，轉(zhuǎn)染48 h后，Western blot檢測(cè)miR-124過表達(dá)或者抑制后Capn4蛋白表達(dá)水平變化，結(jié)果如圖4所示，miR-124 mimics組中Capn4蛋白表達(dá)低于mimics-NC組及空白對(duì)照組（P<0.01），miR-124 in‐hibitor組中Capn4蛋白表達(dá)顯著高于inhibitor-NC組及空白對(duì)照組（P<0.001）。表明miR-124可以下調(diào)Capn4蛋白表達(dá)。

圖4 Western blot檢測(cè)GIST-T1細(xì)胞中Capn4蛋白表達(dá)Fig.4 Western blot was used to detect expression of Capn4 protein in GIST-T1 cells

2.5 miR-124對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路各蛋白表達(dá)的影響細(xì)胞分組同上，轉(zhuǎn)染48 h后，Western blot檢測(cè)miR-124過表達(dá)或者抑制后Wnt-1、βcatenin蛋白表達(dá)水平變化，結(jié)果如圖5所示，miR-124 mimics組中Wnt-1、β-catenin蛋白表達(dá)低于mimics-NC組及空白對(duì)照組（P<0.001），miR-124 inhibitor組中Wnt-1、β-catenin蛋白表達(dá)顯著高于inhibitor-NC組及空白對(duì)照組（P<0.001）。

圖5 Western blot檢測(cè)GIST-T1細(xì)胞中Wnt-1、β-catenin蛋白表達(dá)Fig.5 Protein expressions of Wnt-1，β-catenin were mea?sured by Western blot in GIST-T1 cells

3 討論

microRNA是一種高度保守的非編碼性小RNAs（約為22個(gè)核苷酸）。miRNA在腫瘤中具有差異性表達(dá)，在細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡具有重要作用。miR-124也是其成員之一，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有差異性表達(dá)，并扮演著重要的調(diào)控角色。ZHANG等［17］發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA MALAT1與miR-124相互作用，并通過靶向JAG1調(diào)節(jié)舌癌生長。JIAO等［18］發(fā)現(xiàn)miR-124通過滅活Notch途徑促進(jìn)神經(jīng)元干細(xì)胞的增殖和分化。LI等［19］發(fā)現(xiàn)lncRNA MALAT1通過調(diào)節(jié)miR-124/STAT3促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展。PAN等［20］研究發(fā)現(xiàn)慢病毒介導(dǎo)的miR-124過表達(dá)通過靶向JAG1和EZH2抑制胃癌的生長和侵襲。本研究使用qRT-PCR檢測(cè)胃腸道間質(zhì)瘤組織和癌旁組織中miR-124的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-124在腸道間質(zhì)瘤組織中的表達(dá)量顯著低于癌旁組織，說明miR-124確實(shí)與胃腸道間質(zhì)瘤的發(fā)生有關(guān)。為了進(jìn)一步研究miR-124對(duì)胃腸道間質(zhì)瘤（GIST-T1）細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響，本研究在體外條件下培養(yǎng)GIST-T1細(xì)胞，然后發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-124 mimics可以上調(diào)GIST-T1細(xì)胞miR-124的表達(dá)；CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，上調(diào)miR-124表達(dá)能顯著性降低GIST-T1細(xì)胞增殖；Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示上調(diào)miR-124表達(dá)能明顯降低GIST-T1細(xì)胞遷移；Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示上調(diào)miR-124表達(dá)能明顯抑制GIST-T1細(xì)胞侵襲，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果說明上調(diào)miR-124表達(dá)能明顯促進(jìn)GIST-T1細(xì)胞發(fā)生凋亡。進(jìn)一步說明miR-124在胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞中具有重要作用，能夠抑制細(xì)胞發(fā)生惡性生物學(xué)行為。

目前，miR-124調(diào)控腫瘤發(fā)生的具體機(jī)制尚未明確。CHEN等［21］研究發(fā)現(xiàn)circHIPK3通過miR-124調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移，并調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌中AQP3的表達(dá)。QIAN等［22］發(fā)現(xiàn)miR-124通過抑制整合素αV表達(dá)抑制人肝細(xì)胞癌遷移和侵襲。QIAO等［23］發(fā)現(xiàn)miR-124通過抑制AURKA抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長并增加化學(xué)敏感性。Capn4是鈣蛋白酶的一個(gè)亞基，現(xiàn)有研究表明其在黑色素瘤、鼻咽癌、肝細(xì)胞癌、肝內(nèi)膽管癌和腎細(xì)胞癌中均表達(dá)上調(diào)，說明Capn4在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中確實(shí)具有重要作用。WANG等［24］研究發(fā)現(xiàn)Capn4通過激活Wnt/βcatenin信號(hào)通路促進(jìn)人黑色素瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。ZHENG等［25］發(fā)現(xiàn)Capn4可通過NF-κB誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶2促進(jìn)鼻咽癌轉(zhuǎn)移。CHENG等［26］發(fā)現(xiàn)Capn4通過增加MAPK7促進(jìn)結(jié)直腸癌的增殖。

為了進(jìn)一步研究miR-124調(diào)控胃腸道間質(zhì)細(xì)胞瘤的具體機(jī)制，通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)Capn4可能是miR-124的靶基因，miR-124與Capn4 3'UTR區(qū)存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-124能夠特異性結(jié)合Capn4 3'UTR，并通過Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-124可以下調(diào)Capn4蛋白水平表達(dá)，充分證實(shí)miR-124與Capn4之間具有靶向關(guān)系。CAI等［16］也證實(shí)miR-124通過Capn4在體外抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。

腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲受到多種途徑調(diào)節(jié)，如Wnt/β-catenin、NF-κB和EMT途徑。β-catenin影響許多細(xì)胞過程，包括細(xì)胞增殖、黏附等，其在腫瘤細(xì)胞中也有高表達(dá)［27-28］。β-catenin在多種癌癥中促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，并且在胃腸道間質(zhì)瘤中也具有重要作用［29-30］。本研究Western blot結(jié)果顯示miR-124可以下調(diào)Wnt-1、β-catenin蛋白表達(dá)，從而抑制了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，miR-124可能通過靶向Capn4的表達(dá)，進(jìn)而抑制GIST-T1細(xì)胞的生長和遷移，并促進(jìn)GIST-T1細(xì)胞的凋亡，因此有望成為治療胃腸道間質(zhì)瘤的重要靶點(diǎn)，對(duì)胃腸道間質(zhì)瘤的預(yù)防及治療具有一定意義。本研究尚未證實(shí)Capn4和β-catenin的抑制劑對(duì)GIST-T1細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，后續(xù)將深入研究。