鄒海盯，羅偉

（中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 麻醉科，湖南 長(zhǎng)沙 410011）

0 引言

骨肉瘤患者化療及手術(shù)是常用治療方法，順鉑即順式-二氯二氨合鉑，屬于細(xì)胞周期非特異性藥物，作為一種細(xì)胞周期非特異性抑制劑，在骨肉瘤化療中比較常用。而有研究表明，七氟醚可以增強(qiáng)肺腺癌A549細(xì)胞對(duì)順鉑化療敏感性，其與MMP-2、MMP-9、Ezrin和Fascin蛋白表達(dá)變化有關(guān)[1]。而七氟醚、異氟醚作為骨腫瘤手術(shù)常規(guī)麻醉藥物，其對(duì)骨腫瘤化療敏感性的影響未見(jiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬在體外條件下研究七氟醚、異氟醚對(duì)骨肉瘤MG63化療敏感性的影響及初步探索發(fā)揮作用可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料。骨肉瘤MG63細(xì)胞株由第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院骨腫瘤研究所提供；順鉑（DDP）購(gòu)自山東齊魯制藥廠；異氟醚（Isoflurane，Iso）購(gòu)自魯南貝特制藥有限公司；七氟醚（Sevflurane，Sev）購(gòu)自美國(guó)Baxter公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司；胰酶細(xì)胞消化液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；MTT、Annexin V-FITC凋亡試劑盒、二甲基亞砜（DMSO）、PS（青霉素+鏈霉素）自西安國(guó)安生物科技有限公司；七氟醚、異氟醚吸入式動(dòng)物麻醉機(jī)購(gòu)自上海瑞曼信息科技有限公司；96孔板、培養(yǎng)瓶、6孔板、培養(yǎng)皿購(gòu)自美國(guó)COSTAR公司；麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀購(gòu)自荷蘭Philips公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士帝肯公司；密閉有機(jī)玻璃箱；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；RIPA裂解液購(gòu)自西安晶彩生物科技有限公司；免抗Bcl-2、兔抗Bax購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)：將骨肉瘤MG63細(xì)胞移至培養(yǎng)瓶中，添加5 mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d傳代一次，1∶2傳代。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與藥物處理：對(duì)照組，未用藥物處理；七氟醚組，2.5%七氟醚作用4 h；異氟醚組，2.0%異氟醚處理4 h；順鉑組，10 mg/L的順鉑處理24 h；七氟醚+順鉑組，10 mg/L的順鉑處理24 h，其前4 h用2.5%七氟醚處理；異氟醚+順鉑組，10 mg/L的順鉑處理24 h，其前4 h2.0%異氟醚處理。藥物處理方式：將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿或96孔板中，24 h后將細(xì)胞放置于有機(jī)玻璃箱中，七氟醚或異氟醚揮發(fā)罐與其進(jìn)氣口相連，分析七氟醚或異氟醚濃度的氣體分析儀與其出氣口相連，先打開(kāi)氣體罐（含5% CO2、21 %O2、74 %N2，模擬培養(yǎng)箱中氣體成分），將氣流調(diào)至3 L/min預(yù)充3 min，使該混合氣體充滿(mǎn)密閉容器中，再將流量減至0.5 L/min，打開(kāi)七氟醚或異氟醚揮發(fā)罐，使吸入麻醉藥濃度達(dá)到上述對(duì)應(yīng)濃度，并維持穩(wěn)定狀態(tài)5 min，夾閉進(jìn)氣口和出氣口，將密閉有機(jī)玻璃箱入于37℃恒溫箱中處理4 h，之后取出再置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，20 h后進(jìn)行MTT、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.2.3 MTT檢測(cè)各組細(xì)胞活力：取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MG63細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔加入200 ul，并設(shè)7個(gè)復(fù)孔及1個(gè)只加入培養(yǎng)基的空白對(duì)照孔。培養(yǎng)24 h后，按各組分別處理。每孔加入5 mg/mL MTT，4 h后用DMSO溶解紫色結(jié)晶，在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各組的吸光光度值（OD值），并作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：收集各組細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，固定、染色后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

1.2.5 Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax表達(dá)情況：收集各組細(xì)胞，提取蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量并制樣。再進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%BSA封閉1 h，加入一抗Bcl-2（1:500）和Bax（1:500）4℃雜交過(guò)夜，之后二抗常溫孵育1h，再用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。OD值、細(xì)胞凋亡率、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法（方差齊）或Dunnett’s T3法（方差不齊）。P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組骨肉瘤MG63細(xì)胞活力的比較。10 mg/L順鉑作用MG63細(xì)胞24 h后，細(xì)胞毒性較強(qiáng)（細(xì)胞殺傷率為50%，P＜0.05），七氟醚、異氟醚均對(duì)MG63細(xì)胞的毒性作用微弱（分別為3%和4%，P＜0.05），但與單獨(dú)使用順鉑組相比，七氟醚或異氟醚聯(lián)合使用順鉑，細(xì)胞毒性反而降低（分別為13%和15%）。提示順鉑、七氟醚、異氟醚對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒性，但七氟醚、異氟醚能減弱順鉑對(duì)MG63細(xì)胞的毒性作用，見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞吸光光度值（OD）的比較（±s）

表1 各組細(xì)胞吸光光度值（OD）的比較（±s）

注:與對(duì)照組相比,＊P＜0.05; 與DDP組相比,﹟P＜0.05。

Group Ctrol 2.5%Sev 2.0%Iso DDP 2.5%Sev+DDP 2.0%Iso+DDP OD 0.98±0.05 0.89±0.05＊ 0.89±0.06＊ 0.37±0.08 0.50±0.02﹟ 0.50±0.03﹟

2.2 各組MG63細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)的凋亡率的比較。七氟醚+順鉑組（37.7%）和異氟醚+順鉑組（40.3%）與單純順鉑組（50.8%）相比，細(xì)胞凋亡明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示七氟醚和異氟醚能夠減弱順鉑對(duì)骨肉瘤MG63的細(xì)胞毒性，見(jiàn)表2、圖1、圖2。

表2 各組細(xì)胞凋亡率（OR）的比較（±s）

表2 各組細(xì)胞凋亡率（OR）的比較（±s）

注:與DDP組相比＊P＜0.05。

Group Ctrol 2.5%Sev 2.0%Iso DDP 2.5%Sev+DDP 2.0%Iso+DDP OR 6.76±0.33 5.66±1.15 5.16±1.14 50.8±2.81＊ 37.7±5.34＊ 40.3±1.96＊

圖1 各組細(xì)胞凋亡率的比較

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

2.3 各組骨肉瘤MG63細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平的比較。七氟醚+順鉑組（63%）和異氟醚+順鉑組（63%）與單純順鉑組（123%）相比，Bax蛋白表達(dá)水平降低，七氟醚+順鉑組（22%）和異氟醚+順鉑組（36%）與單純順鉑組（40%）相比，Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示七氟醚和異氟醚降低順鉑對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞的細(xì)胞毒性可能與Bcl-2、Bax有關(guān)。見(jiàn)表3、圖3、圖4、圖5。

圖4 各組Bax蛋白表達(dá)水平與順鉑組相比

圖5 各組Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

表3 各組MG63細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

表3 各組MG63細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

Note: ﹟P＜0.01,與DDP組相比，＊P＜0.05,與DDP組相比。

Group Bax Bcl-2 DDP 1.23±0.20 0.22±0.08 2.5%Sev+DDP 0.63±0.12﹟ 0.36±0.08＊2.0%Iso+DDP 0.63±0.13﹟ 0.40±0.12＊

圖3 各組Bcl-2蛋白表達(dá)水平與順鉑組相比

3 討論

骨肉瘤是臨床常見(jiàn)的原發(fā)性惡性骨腫瘤，常見(jiàn)于青少年。70年代以前關(guān)節(jié)離斷和截肢為治療骨肉瘤主要手段主，5年生存率維持在20%左右。70年代后，化療聯(lián)合手術(shù)治療使骨肉瘤患者5年無(wú)病生存率超過(guò)50%[3-4]。順鉑常用作骨肉瘤患者的化療。其可抑制腫瘤細(xì)胞DNA合成及復(fù)制，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。近年有國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，麻醉藥可影響順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[5]。國(guó)內(nèi)也有研究發(fā)現(xiàn)嗎啡可減弱順鉑對(duì)人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的殺傷作用，其機(jī)制可能與嗎啡改變Bcl-2、Bax表達(dá)相關(guān)[6]。又有研究發(fā)現(xiàn)七氟醚對(duì)艾氏腹水腫瘤細(xì)胞有一定的細(xì)胞毒性作用，而當(dāng)七氟醚與順鉑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，其可減弱順鉑對(duì)艾氏腹水腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用；而七氟醚可增強(qiáng)順鉑對(duì)外周血白細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞的細(xì)胞毒性[7]。而梁樺等發(fā)現(xiàn)七氟醚可增強(qiáng)順鉑對(duì)人肺腺癌A549的殺傷作用。對(duì)于麻醉藥促進(jìn)或減弱順鉑對(duì)各種細(xì)胞的毒性作用，可能與細(xì)胞種類(lèi)有關(guān)。

本研究應(yīng)用七氟醚、異氟醚聯(lián)合順鉑作用于骨肉瘤MG63細(xì)胞，觀察七氟醚、異氟醚對(duì)順鉑對(duì)骨肉瘤mg63細(xì)胞毒性的影響，并探討相關(guān)機(jī)制。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)10 mg/L順鉑處理骨肉瘤24 h后可引起50%左右的細(xì)胞凋亡，故選用順鉑的濃度為10 mg/L。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)及前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究最終決定選擇2.5%七氟醚、2.0%異氟醚作為處理骨肉瘤細(xì)胞的最終濃度。MTT及流式細(xì)胞結(jié)果表明，與單純順鉑組相比，七氟醚聯(lián)合順鉑及異氟醚聯(lián)合順鉑組骨肉瘤MG63活力較高，凋亡率較低，提示七氟醚、異氟醚可以降低骨肉瘤MG63細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性。Bcl-2蛋白家族與細(xì)胞凋亡有關(guān)其包括Bcl-2、Bax等，其中Bcl-2有抗凋亡作用，Bax有促凋亡作用[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)應(yīng)用順鉑組相比，七氟醚聯(lián)合順鉑及異氟醚聯(lián)合順鉑可上調(diào)Bcl-2表達(dá)并下調(diào)Bax表達(dá)。而B(niǎo)cl-2、Bax表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。因此七氟醚、異氟醚降低骨肉瘤MG63細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性可能與其上調(diào)Bcl-2表達(dá)和下調(diào)Bax的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，七氟醚、異氟醚降低骨肉瘤MG63細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性，其機(jī)制可能與上調(diào)Bcl-2及下調(diào)Bax蛋白表達(dá)相關(guān)。后續(xù)我們將利用各種生物技術(shù)手段研究其具體機(jī)制，為臨床麻醉藥物的選擇提供一定的依據(jù)。