王曉棟 李強 滕騰 陸姿贏 嚴金 方宇

深靜脈血栓形成（deep vein thrombosis,DVT）是由于血流滯緩、靜脈壁損傷和血液高凝狀態(tài)因素引起血液在深靜脈腔中不正常凝結(jié)，并阻塞靜脈腔引起的一種高發(fā)病率、高致殘率和易反復(fù)發(fā)作的周圍血管病[1-2]。其臨床表現(xiàn)主要為肢體廣泛性腫脹、疼痛、皮色暗紅、淺靜脈擴張等特點。早期DVT的血栓易脫落，會引發(fā)致命性肺栓塞。后期因靜脈瓣膜破壞，患肢會出現(xiàn)腫脹、色素沉著、濕疹性皮炎、慢性潰瘍等DVT后綜合征[3]。祖國醫(yī)學(xué)認為本病主要是因為創(chuàng)傷、骨折或長期臥床，導(dǎo)致肢體氣血運行不暢、氣滯血瘀，淤血阻于脈絡(luò)，脈絡(luò)滯塞不通，靜脈血回流受阻，水津外溢，聚而為濕，發(fā)為本病。臨床上多用辯證分型，內(nèi)治法及外治法對其進行治療[4]。

參附注射液源自《校注婦人良方·卷九》之參附湯，由紅參、黑附片（附子）經(jīng)過現(xiàn)代工藝加工制備而成，其主要活性成分為人參皂苷和烏頭類生物堿。紅參作為“大補元氣之藥”具有補元氣、復(fù)脈固脫、益氣攝血的作用。附子被稱為“回陽救逆第一品藥”，能夠回陽救逆、補火助陽、散寒止痛。兩者合用，具有益氣溫陽、振奮心陽、回陽救逆、益氣固脫、溫通心脈等多重功效。主要可用于治療暴脫引起的厥脫癥（感染性、失血性、失液性休克等），以及陽虛（氣虛）導(dǎo)致的驚悸、喘咳、胃痛、泄瀉、痹癥等[5]。此外，參附注射液具有抑制血小板凝聚，降低血液黏稠度，單用或聯(lián)用具有防治DVT的作用，但其作用機制尚不明確[6]。隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)概念的應(yīng)運而生，基于化學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物數(shù)據(jù)等多學(xué)科整合，依托計算模擬建立藥理學(xué)性質(zhì)預(yù)測模型，為闡明中藥復(fù)方制劑多成分、多靶點作用機制及其相應(yīng)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了新的思路。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，運用文獻檢索、分子在線模擬找靶、基因本體論分析、KEGG通路富集分析等手段，對參附注射液治療的生物分子藥理機制進行網(wǎng)絡(luò)分析，為探尋其防治DVT的作用提供理論線索。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)庫和軟件 所涉及數(shù)據(jù)庫和軟件如下：（1）CNKI 數(shù) 據(jù) 庫 ，https://www.cnki.net/；（2）ChemicalBook數(shù)據(jù)庫，http://www.chemicalbook.net；（3）SIB 分子結(jié)構(gòu)活性相似性靶標預(yù)測服務(wù)器，http://www.swissparam.ch/；（4）GeneCards 基因數(shù)據(jù)庫，https://www.genecards.org/；（5）DisGeNet疾病基因相關(guān)數(shù)據(jù)庫，https://www.disgenet.org/；（6）STRING 數(shù)據(jù)庫，https://string-db.org/；（7）RCSB PDB 蛋 白 質(zhì) 數(shù) 據(jù) 庫 ，http://www.rcsb.org；（8）DAVID 數(shù) 據(jù) 庫 ，https://david.ncifcrf.gov/；（9）Cytoscape可視化網(wǎng)絡(luò)處理軟件，版本號 3.7.2；（10）Cluego，Cytoscape 軟件平臺插件，2.5.7；（11）ChemOffice，版本號19.0；（12）AutoDock Vina 分子對接平臺，版本號 1.1.2。本研究在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論的指導(dǎo)下，探討參附注射液中有效成分治療DVT的作用機制，通過構(gòu)建“成分-靶點”的網(wǎng)絡(luò)，旨在為DVT的臨床治療及擬開展的實驗驗證研究提供理論支持。

1.2 參附注射液主要成分選擇及靶標集合構(gòu)建 在CNKI數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)鍵詞為“參附”“成分”進行檢索，歸納出與參附注射液成分相關(guān)的文獻，再篩選出經(jīng)高效液相色譜和超高效液質(zhì)聯(lián)用等檢測手段的成分研究文獻，匯總整理出參附注射液中主要的有效成分，最后通過ChemicalBook數(shù)據(jù)庫逐一核對化合物成分的中英文名稱、CAS號，并以mol格式結(jié)構(gòu)文檔然后保存。將mol格式文檔輸入SIB分子結(jié)構(gòu)活性相似性靶標預(yù)測服務(wù)器中，對化合物潛在靶點進行預(yù)測，即釣靶。

1.3 中藥成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 整理歸納參附注射液中的有效成分及靶點基因，而后歸類導(dǎo)入到Cytoscape3.7.2軟件中進行可視化分析，構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。利用軟件自帶的“Network Analyzer”插件對網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析。“度值”“介數(shù)”“最短距離”是分析網(wǎng)絡(luò)中心性的關(guān)鍵參數(shù)，度值、介數(shù)、最短路徑越大，該節(jié)點就越重要。其中度值為關(guān)鍵信息，歸類篩選出關(guān)鍵化合物。

1.4 DVT相關(guān)疾病基因構(gòu)建 分別利用GeneCards和DisGeNet數(shù)據(jù)庫，以“deep vein thrombosis”為檢索詞，獲取與DVT相關(guān)的靶點。將兩個數(shù)據(jù)的結(jié)果匯總、去重，建立兩者之間的合集，從而獲得DVT相關(guān)的疾病基因集合。

1.5 參附注射液-DVT潛在治療靶點集合及其蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 對參附注射液靶基因和DVT基因取交集，從而獲取參附注射液治療DVT的潛在治療靶點集合，并繪制韋恩圖。將潛在治療靶點基因?qū)氲絊TRING數(shù)據(jù)庫平臺，背景設(shè)置為“homo sapiens”（智人），其他參數(shù)為默認值，構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction,PPI），將得到的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.7.2處理軟件，利用“Network Analyzer”插件對該網(wǎng)絡(luò)做拓撲分析，并且分析其中心的性靶標參數(shù)。

1.6 GO生物過程的分析 利用Cytoscape3.7.2軟件中的ClueGo插件對參附注射液-DVT潛在治療靶點靶基因的GO生物的過程進行分析，發(fā)現(xiàn)潛在的藥理作用，用于解釋藥物靶點防治DVT的過程。參數(shù)設(shè)置為“homo sapiens”，P≤0.05，選擇“use go term fusion”，設(shè)置interval min level=4，max level=7。

1.7 KEGG富集通路分析 利用DAVID 6.8v數(shù)據(jù)庫對潛在治療靶點基因進行KEGG信號通路富集分析，挑選出P＜0.05的參附注射液發(fā)揮治療作用可能的信號通路，并運用R語言進行可視化分析。

1.8 參附注射液主要活性成分與對應(yīng)的靶點蛋白的分子對接驗證 分子對接是通過受體的特征以及受體和藥物分子之間的相互作用方式來進行藥物設(shè)計的方法，主要研究分子間（如配體和受體）相互作用，按照幾何互補和能量互補的原則來實時評價配體和受體的相互作用，尋找最佳結(jié)合模式理論模擬方法。

使用AutoDock Vina 1.1.2對參附注射液中主要成分化合物和度值排名靠前的核心靶點進行分子對接實驗。將得到的主要成分化合物件導(dǎo)入到ChemDraw3D軟件中調(diào)整化合物的空間構(gòu)象，Minimize能量優(yōu)化，再保存為mol2模式。然后利用AutoDock vina中的AutoDock Tools工具分配電荷、設(shè)置可旋轉(zhuǎn)鍵后再保存成pdbqt格式的文件。從PDB下載靶蛋白的3D晶體的結(jié)構(gòu)，去除靶蛋白水分子分離原始的配體和受體，得到的靶蛋白導(dǎo)入到AutoDock進行加氫、分配電荷、添加原子類型后保存成pdbqt格式的文件。最后利用AutoDock Vina 1.1.2進行分子對接，以及GraphPad Prism 8將化合物以及對應(yīng)的靶蛋白對接得到的結(jié)合能構(gòu)建熱圖。

2 結(jié)果

2.1 參附注射液的主要活性成分 通過文獻檢索，共得到參附注射液成分研究的文獻50篇，其中通過高效液相色譜和超高效液質(zhì)聯(lián)用等檢測手段共6篇文獻，具體信息見表1、2。

表1 紅參主要活性成分

表2 附子主要活性成分

本研究通過檢索文獻，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過高效液相色譜法和超高效液相色譜法檢測過的參附注射液含有多種皂苷和生物堿成分，如人參皂苷 Rd、Rg1、Rb1、Ro、Rc、Rb2、Rf、Ra2、Rh1、Re、F1、Rb3，20-葡糖人參皂苷 R、三七皂苷R1、竹節(jié)參皂苷Ⅳa等15種皂苷成分，有新烏頭堿、尼奧靈、塔拉烏頭胺、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、次烏頭堿、烏頭堿等7種生物堿。將其統(tǒng)一保存成mol2格式文件，并對其進行網(wǎng)絡(luò)分析，主要的成分信息見表3。

表3 參附注射液主要活性成分

2.2 參附注射液的潛在靶標及藥物成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過SIB服務(wù)器進行靶點預(yù)測后，共發(fā)現(xiàn)參附注射液中22種有效成分共對應(yīng)的有114個潛在靶標，其中人參皂苷類成分所對應(yīng)的靶標數(shù)目最多、藥理作用也比較廣，推測為參附注射液的主要活性成分。結(jié)果見表4。將有效成分和對應(yīng)靶點導(dǎo)入到Cytoscape中后，得到成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。

圖1 參附注射液化合物-成分靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

表4 SIB服務(wù)器靶點預(yù)測結(jié)果

根據(jù)度值從大到小排序，篩選出6個關(guān)鍵化合物，分別為人參皂苷Ra2，人參皂苷Rh1，次烏頭堿，人參皂苷Rd，人參皂苷Rb1，人參皂苷Rb3，見表5。

表5 參附注射液的主要化合物信息

2.3 潛在治療靶點和PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫和DisGeNet數(shù)據(jù)庫平臺分別搜索與DVT相關(guān)的基因。匯總、去重后，共得到2 155個基因，再與114個參附注射液活性成分的基因建立交集，共得到43個潛在的治療靶基因。

將潛在的治療靶基因?qū)氲絊TRING數(shù)據(jù)庫平臺，然后構(gòu)建參附注射液的PPI網(wǎng)絡(luò)，排除沒有發(fā)生互相作用的基因，見圖2（插頁）。由圖2可見，共有42個基因參與了網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，整個網(wǎng)絡(luò)共包括204條相互作用的線，平均度值（degree）為9.71，平均最短距離（closeness）為 4.9×10-1，平均介數(shù)（betweenness）為 2.85×10-2。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點度值越大，說明其在PPI網(wǎng)絡(luò)中就越重要，在生物學(xué)功能中起著更為重要的作用。度值排名前 5 的靶基因為 AKT1、VEGFA、HSP90AA1、MAPK1、PIK3CA，見表6。這些靶基因可能是參附注射液防治DVT的關(guān)鍵靶基因。

表6 參附注射液防治DVT的可能關(guān)鍵靶基因

2.4 GO生物過程分析 將42個抗DVT的靶基因進行GO生物過程分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)涉及了72個GO生物過程條目，總共322條相互作用關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)線，見圖3（插頁）。其中GO生物過程條目可以分為5類，肽酰蘇氨酸磷酸化（60.38%），內(nèi)皮細胞增殖的正調(diào)控（30.19%），磷脂酰肌醇介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)（3.77%），ERBB信號通路（3.77%），兒茶酚胺刺激的細胞反應(yīng)（1.89%）。由此得出，肽酰蘇氨酸磷酸化、內(nèi)皮細胞增殖的正調(diào)控與DVT緊密相關(guān)。

2.5 KEGG富集通路分析 將42個抗DVT的靶基因?qū)氲紻AVID 6.8v數(shù)據(jù)庫中，通過篩選P＜0.05，得到85條富集通路，以基因的數(shù)量和P值為篩選條件，運用R語言選取前30條通路進行可視化分析，見圖4。其中每條通路包含的基因數(shù)量越多且P值越小，該通路就與疾病越密切。其中42個基因中有27個基因參與了前30條相關(guān)通路的富集。可見，基因主要富集在癌癥通路（pathways in cancer）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、Rap1 信號通路（Rap1 signaling pathway）、Ras信號通路（Ras signaling pathway）、ErbB 信號通路（ErbB signaling pathway）、VEGF 信號通路（VEGF signaling pathway）、雌激素信號通路（estrogen signaling pathway）、mTOR 信號通路（mTOR signaling pathway）、cAMP信號通路（cAMP signaling pathway）、T細胞受體信號通路（T cell receptor signaling pathway）、FcεRI信號通路（Fc epsilon RI signaling pathway）、B細胞受體信號通路（B cell receptor signaling pathway）。

圖4 KEGG通路分析

2.6 分子對接結(jié)果 一般認為受體和配體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時的能量越低，發(fā)生的作用可能性就越大，根據(jù)文獻記載，結(jié)合能＜-5 kcal/mol表明配體小分子和受體蛋白之間有著較好的結(jié)合活性[15]。結(jié)合能＜-8 kcal/mol表示配體小分子和受體蛋白之間存在強烈的結(jié)合活性[16]。如圖5所示，核心化合物和AKT1、VEGFA、HSP90AA1、MAPK1、PIK3CA結(jié)合能均＜-5 kcal/mol，提示化合物和靶蛋白的結(jié)合活性較高。HSP90AA1對接人參皂苷Ra2，MAPK1對接人參皂苷Ra2和人參皂苷Rh1，PIK3CA對接人參皂苷Rd、Rh1的結(jié)合能＜-8 kcal/mol。分子對接的結(jié)果顯示通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進行篩選得到的核心化合物和核心靶點都具有比較好的結(jié)合活性。

圖5 參附注射液的核心化合物與關(guān)鍵靶點對接得分熱圖

3 討論

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明 AKT1、VEGFA、HSP90AA1、MAPK1、PIK3CA等可能是參附注射液治療DVT的關(guān)鍵靶點。研究表明VEGFA具有促進血管內(nèi)皮細胞的分裂和增殖、增加微靜脈和小靜脈的通透性、誘導(dǎo)血管生成、改善血液供應(yīng)等功能[17]。Akt1通過磷酸化底物蛋白激活下游信號級聯(lián)反應(yīng)，參與調(diào)控多個相關(guān)基因家族轉(zhuǎn)錄，影響細胞生長、存活、增殖、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成、細胞遷移運動等多種細胞活動[18]。抑制HSP90AA1的表達能夠發(fā)生抗炎、抗氧化內(nèi)激、調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能等作用[19]。PIK3CA的p110alpha催化亞基的作用對于內(nèi)皮細胞遷移和血管的生成至關(guān)重要，研究表明體細胞激活A(yù)KT1和PIK3CA變體會引起特定血管內(nèi)皮功能障礙，特別是內(nèi)皮黏附分子，這是已知的血栓形成因素和獲得性血栓形成前的危險因素[20]。

GO生物過程結(jié)果分析表明，參附注射液治療DVT可能是通過肽酰蘇氨酸磷酸化，內(nèi)皮細胞增殖的正調(diào)控，磷脂酰肌醇介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，ERBB信號通路，兒茶酚胺刺激的細胞反應(yīng)等生物過程發(fā)揮恢復(fù)血管功能，改善血液循環(huán)和組織代謝，抑制炎癥反應(yīng)，抑制細胞凋亡等作用。KEGG富集通路結(jié)果分析表明了PPI網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶點主要富集了癌癥通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路、Rap1信號通路、Ras信號通路等。研究表明HIF-1信號通路是由α和β亞基組成的異二聚核轉(zhuǎn)錄因子，缺氧和HIF-1α的穩(wěn)定與自然中形成的血栓中血管生成性HIF-1靶標水平的升高有關(guān)，防止血栓中的HIF-1α降解可以增強靜脈再通，血栓新血管形成和血栓消退。血栓的消融也通過與它所附著的靜脈壁的相互作用來調(diào)節(jié)，并且壁內(nèi)的血管生成反應(yīng)可能是血栓內(nèi)許多通道的來源[21]。PI3K-Akt信號通路被認為是血管內(nèi)皮細胞凋亡信號通路之一，在這個過程中，PI3K-Akt信號通路可以進一步激活內(nèi)皮一氧化氮合酶，并最終促進內(nèi)皮細胞的遷移，這對調(diào)節(jié)血管穩(wěn)態(tài)和血管生成至關(guān)重要[22]。Su等[23]指出，抑制PI3K信號通路可能是血栓性疾病的有希望的治療靶標。嚴格控制RAP1信號通路中的CalDAG-GEFI和RASA3之間的拮抗作用平衡，對于預(yù)防循環(huán)中的血小板過早活化

以及在血管損傷部位形成止血栓都是至關(guān)重要的。在血小板循環(huán)的健康血管中，RASA3具有抑制不受控制的RAP1活化并保持靜態(tài)，非黏附狀態(tài)（無整聯(lián)蛋白活化）的活性。在血管損傷的部位，血小板刺激導(dǎo)致細胞質(zhì)Ca2+水平增加，致密顆粒釋放ADP。Ca2+激活CalDAGGEFI，后者介導(dǎo)RAP1的GTP快速加載。ADP刺激P2Y12受體，從而導(dǎo)致RASA3功能下降和RAP1信號持續(xù)傳遞?？焖俸统掷m(xù)的RAP1整聯(lián)蛋白活化導(dǎo)致在廣泛的血流動力學(xué)剪切條件下形成穩(wěn)定的三維血栓。P2Y12抑制劑（例如氯吡格雷）可防止RASA3失活，禁止持續(xù)的RAP1信號傳導(dǎo)并破壞血栓的生長[24]。

分子對接結(jié)果顯示，HSP90AA1對接人參皂苷Ra2、MAPK1對接人參皂苷Ra2和人參皂苷Rh1，PIK3CA對接人參皂苷Rd、Rh1具有很高的活性。人參皂苷Ra2、人參皂苷Rh1和人參皂苷Rd可能是治療DVT的活性成分。

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接驗證提示，參附注射液中人參皂苷Ra2，人參皂苷Rh1和人參皂苷Rd具有防治DVT的機制，治療DVT的機制可能通過HIF-1信號通路、抑制PI3K-AKt信號通路，抑制Rap1等信號通路有關(guān)，通過調(diào)控 AKT1、VEGFA、HSP90AA1、MAPK1、PIK3CA等基因的表達發(fā)揮抗炎、抗氧化內(nèi)激、調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能、促進血管內(nèi)皮細胞的分裂和增殖、增加微靜脈和小靜脈的通透性、誘導(dǎo)血管生成、改善血液供應(yīng)、抑制細胞凋亡、調(diào)節(jié)血管穩(wěn)態(tài)以及破壞血栓生成的作用。本研究揭示了中藥制劑多成分-多靶點-多通路的特點，為參附注射液治療DVT這一后續(xù)臨床試驗提供了一定的理論基礎(chǔ)。