王華 應(yīng)勤來 劉曉琳 王天驕 朱佳聰 滕懿群

急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia,ALL）是兒童常見腫瘤之一。甲氨蝶呤（methotrexate,MTX）作為大多數(shù)化療方案中抗癌劑的核心，在ALL臨床治療上取得了明顯療效，但大劑量MTX在提高治愈率的同時，也不可避免地產(chǎn)生消化道黏膜損害、血液毒性、肝腎損害等毒性反應(yīng)。研究表明，MTX血藥濃度與臨床療效、毒性反應(yīng)關(guān)系密切，但不同個體間化療效果及毒性反應(yīng)差異很大且原因復雜[1-3]，其中基因多態(tài)性是重要原因之一，主要為編碼MTX膜轉(zhuǎn)運蛋白基因的序列差異[4-5]。MTX的外向轉(zhuǎn)運蛋白是ABC亞家族G成員2（ABC subfamily G member 2,ABCG2）[6]，ABCG2 基因編碼的P-糖蛋白在多種組織中既可以作為功能屏障，又可以作為外排轉(zhuǎn)運蛋白，其過度表達可導致多藥耐藥，并影響多種抗癌藥物的藥代動力學。研究表明，ABCG2基因中的變體可改變P-糖蛋白的表達和功能[7]。盡管MTX不被視為P-糖蛋白底物，但是MTX單藥治療的研究表明，沉默的ABCG2基因多態(tài)性可能影響MTX化療效果和毒性反應(yīng)[8]。目前關(guān)于ABCG2單核苷酸多態(tài)性在ALL患兒中影響的臨床研究較少，故本研究對ABCG2基因多態(tài)性與ALL患兒大劑量MTX化療效果及毒性反應(yīng)的關(guān)系作一探討，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2012年1月至2018年12月嘉興市第二醫(yī)院新診斷的167例ALL患兒為研究對象，男80例，女 87 例；年齡 1～18[4.9（1.1，11.3）]歲；免疫表型：B細胞140例，T細胞21例，雙表型2例，未表型4例；診斷時 WBC＜50×109/L 78例，≥50×109/L 89例；染色體≥50條101例，＜50條66例；大劑量MTX化療后首次緩解133例，發(fā)生事件34例；融合基因檢測結(jié)果：BCR-ABL1（+）12 例，TEL-AML1（+）4 例，E2A/PBX1（+）11 例，MLL-AF4（+）5 例。入組標準：（1）ALL 的診斷符合兒童ALL診療建議（第三次修訂草案）中相關(guān)標準[9]；（2）DNA 樣本和臨床數(shù)據(jù)具備可用性；（3）均接受 CCLG-2008 方案治療；（4）無唐氏綜合征；（5）既往無惡性腫瘤史；（6）在化療鞏固治療前無肝腎功能不全或受損。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會審查通過，所有患兒或家屬簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 化療方法 根據(jù)患兒年齡、WBC、免疫表型、細胞遺傳學和分子畸變、強的松不良反應(yīng)、誘導治療結(jié)束時的形態(tài)學緩解（基于BFM風險標準）、治療結(jié)束時的微小殘留病變情況綜合評估，標準風險（SR）69例，中間風險（IR）98例。參照CCLG-2008誘導治療方案和鞏固治療方案進行治療[10]。在化療鞏固階段（第8、22、36、50天），患兒每2周接受1次大劑量MTX化療。大劑量MTX給藥方式如下：總劑量的10%在0.5 h內(nèi)通過靜脈輸注給予，剩余的90%在23.5 h內(nèi)給予（SR、IR患兒的MTX劑量分別為2、5 g/m2）。在大劑量MTX輸注開始后42、48和54 h，以15 mg/m2的劑量進行甲酰四氫葉酸解救治療。48 h后的高血漿MTX濃度（＞0.25 μmol/L）作為延長解救的指示；每天檢測血漿中MTX濃度，直至低于 0.2 μmol/L。

1.2.2 基因分型 取外周血白細胞和（或）存檔的骨髓載玻片，分別使用FlexiGene試劑盒（德國Qiagen公司）、QIAamp DNA Mini試劑盒（德國Qiagen公司）提取DNA。使用限制性片段長度多態(tài)性PCR基因分型方法測定 ABCG2基因rs2231137、rs2231142位點的基因型。PCR 擴增條件：初始變性（95 °C，10 min），40個變性循環(huán)（95 °C，15 s），退火（60 °C，1 min）和延伸（72 °C，1 min）和延長（72 °C，7 min）。rs2231137引物序列：正向為 5'-CCCAGAGTCCTTATTCTTAGCC-3'，反向為 5'-GTGCCTCCTTCACACACAG-3'。rs2231142 引物序列：正向為5'-TGTTGTGATGGGCACTCTGATG-3'，反向為5'-ATCAGAGTCATTTTATCCACAC-3'。擴增完成后，將限制酶HpyCH4IV加入PCR產(chǎn)物中并在37℃下孵育4 h，使用溴化乙錠染色的3%瓊脂糖凝膠電泳分析限制性片段長度多態(tài)性。

1.2.3 MTX血藥濃度測定 在開始輸注MTX后的第48、72 h采集患兒2 ml血液樣本，采用熒光偏振免疫分析法測定血漿MTX濃度，即MTX血藥濃度。

1.2.4 毒性反應(yīng)評估 在大劑量MTX輸注結(jié)束到下一個大劑量MTX周期間隔或大劑量MTX輸注后14 d評估每個大劑量MTX周期后患兒的毒性反應(yīng)，包括血液毒性、肝毒性、腎功能損傷、胃腸道毒性、口腔黏膜炎等。血液毒性定義為血清Hb、WBC、PLT降低。肝毒性定義為血清ALT、AST或γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶水平升高。腎功能損傷定義為血清肌酐或尿素水平升高。胃腸道毒性定義為存在腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐、腸梗阻。根據(jù)美國國家癌癥研究所常見毒性標準4.0版對毒性進行分級，選擇鞏固治療期間最高等級的毒性作為分析的終點。

1.2.5 生存評估 所有患兒中位隨訪時間75個月，記錄72個月無事件生存率（event free survival,EFS）。事件包括任何部位的疾病復發(fā)、任何原因的死亡或其他惡性腫瘤的發(fā)生等。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件。對每個位點基因型頻率分布進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ALL患兒ABCG2基因型分布 167例ALL患兒ABCG2的2個位點rs2231137、rs2231142基因型分布頻率見表1，經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗，提示該研究人群具有代表性（均P＞0.05）。

表1 ALL患兒ABCG2的2個位點基因型分布頻率（n=167）

2.2 不同基因型患兒MTX血藥濃度比較 在rs2231137位點，GG與AG+AA基因型患兒鞏固治療期間第48、72 h時MTX血藥濃度比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；在rs2231142位點，CT+TT基因型患兒鞏固治療期間第48、72 h時MTX血藥濃度均高于CC基因型患兒，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 不同基因型患兒MTX血藥濃度比較（μmol/L）

2.3 不同基因型患兒大劑量MTX化療毒性反應(yīng)及用藥延遲時間比較 167例ALL患兒接受大劑量MTX化療的毒性反應(yīng)主要有血液毒性（80.8%）、胃腸道毒性（36.5%）、口腔黏膜炎（26.9%）、肝毒性（23.4%）、腎功能損傷（17.4%）。在rs2231137位點，GG、AG、AA基因型患兒大劑量MTX化療毒性反應(yīng)比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；在rs2231142位點，CT、TT基因型患兒腎功能損傷發(fā)生率較CC基因型患兒明顯升高（P＜0.05），而其余大劑量MTX化療毒性反應(yīng)各基因型比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。因化療毒性反應(yīng)導致大劑量MTX鞏固治療用藥延遲≤2周154例（92.2%），＞2周13例（7.8%）；rs2231137、rs2231142位點各基因型患兒用藥延遲情況比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表 3。

表3 不同基因型患兒大劑量MTX化療毒性反應(yīng)及用藥延遲時間比較[例（%）]

2.4 不同基因型患兒大劑量MTX化療后EFS比較 在rs2231137位點，GG與AG+AA基因型患兒72個月EFS比較[（88.5±1.7）%比（83.3±3.2）%]，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在rs2231142位點，CC與CT+TT基因型患兒72個月EFS比較[（90.2±1.8）%比（81.5±4.6）%]，差異亦無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

大劑量MTX在改善ALL的治愈率方面具有重要作用，但個體間差異也很大[5]。基因多態(tài)性是導致個體間差異的重要原因之一。在以往的研究中，涉及MTX轉(zhuǎn)運體通路的基因中有多個單核苷酸多態(tài)性參與MTX的藥代動力學和臨床效應(yīng)，但結(jié)果并不明確[11-12]。因此，本研究對接受CCLG-2008方案治療的ALL患兒ABCG2基因多態(tài)性與大劑量MTX化療效果及毒性反應(yīng)的相關(guān)性作一探討，結(jié)果顯示ABCG2的rs2231142位點多態(tài)性與腎功能損傷發(fā)生率升高有關(guān)。Liu等[12]研究表明，ABCG2的rs2231142位點多態(tài)性與MTX化療毒性反應(yīng)無關(guān)，與本研究結(jié)果不同。目前也有其他研究分析ABCG2基因多態(tài)性與大劑量MTX化療毒性反應(yīng)的關(guān)系，但結(jié)果并不一致[12-13]。這種差異的解釋可能是大劑量MTX化療后服用四氫葉酸，從而降低了大劑量MTX的毒性反應(yīng)。

大劑量MTX誘導的腎功能損傷常發(fā)生在穩(wěn)態(tài)血漿濃度結(jié)束時或結(jié)束后不久，其誘導腎功能損傷的可能機制如下：（1）腎小管尿液中MTX的pH依賴性沉淀；（2）來自傳入小動脈血管收縮的腎灌注減少；（3）直接小管毒性的腎小管內(nèi)MTX攝取減少[14-15]。鑒于大劑量MTX誘導腎臟損傷的發(fā)生時間以及在大劑量MTX輸注前、中、后通過堿化尿液和四氫葉酸補救均能有效預防大劑量MTX誘導的腎功能損傷，目前相對認可腎小管尿液中MTX的pH依賴性沉淀導致腎毒性發(fā)生的觀點[16]。迄今為止，rs2231142多態(tài)性與大劑量MTX相關(guān)腎功能損傷機制尚未明確，不過已有研究表明TT基因型可能是大劑量MTX化療毒性反應(yīng)的傾向因子[12]。本研究結(jié)果也顯示，rs2231142位點TT基因型與大劑量MTX相關(guān)腎功能損傷發(fā)生率升高相關(guān)。目前原因暫不明確，筆者查閱既往文獻發(fā)現(xiàn)，rs2231142位點TT、TC基因型酶的活性分別是CC基因型的70%和40%，而rs2231137位點AA基因型酶的活性僅為GG基因型的30%[10]?？梢姡啾扔趓s2231137位點變異，rs2231142位點變異使ABCG2轉(zhuǎn)運能力下降更為明顯，可導致更多的MTX留在胞外，進而形成MTX沉淀，誘發(fā)腎功能損傷。

本研究還檢測了48、72 h時MTX血藥濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在rs2231142位點CT+TT基因型患兒MTX血藥濃度均明顯高于CC基因型患兒。在大劑量MTX化療期間，MTX主要通過腎臟以原型排泄，足量的水化和堿化可以清除體內(nèi)大部分MTX，但分布至各組織和間液中的MTX與血藥濃度達到平衡的速度很慢，且清除率低[17]，這部分MTX除通過腎臟排泄外，還需依賴于肝臟等其他代謝途徑，而肝臟代謝途徑中的轉(zhuǎn)運體OATP1B1能起到有效限制MTX清除的作用[18]?？梢?，ABCG2基因多態(tài)性與MTX組織分布、肝臟攝取代謝、治療效果等密切相關(guān)。因此，對于大劑量MTX化療過程中血藥濃度異常增高的患兒，當其他非基因因素不能解釋時，可以用是否存在藥物遺傳學差異來解釋，但仍需要在基因檢測與遺傳變異方面作進一步探究。

近年來，關(guān)于ABCG2基因多態(tài)性與ALL患兒生存預后關(guān)系的研究結(jié)果并不一致[12-13]。Liu等[12]發(fā)現(xiàn)rs2231142位點是ALL患兒生存預后的獨立影響因素。Chang等[19]研究發(fā)現(xiàn)rs2231142位點與136例中國ALL患兒復發(fā)風險無關(guān)。但是，上述研究結(jié)果均顯示TT+TC基因型患兒60個月EFS低于CC基因型患兒?；谶@些數(shù)據(jù)，筆者推測具有rs2231142位點T等位基因的患兒可能具有更高的復發(fā)風險。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TT+TC基因型患兒72個月EFS低于CC基因型患兒，但差異無統(tǒng)計學意義。本研究的中位隨訪時間長于上述2個研究的隨訪時間，理論上復發(fā)例數(shù)會增多，因為ALL復發(fā)往往發(fā)生在后期低風險患兒[20]。因此，目前結(jié)果可能表明ABCG2基因多態(tài)性并不能作為ALL患兒存活的有效標志物，針對rs2231142位點多態(tài)性與EFS之間的關(guān)系仍需要進一步研究明確。

綜上所述，ALL患兒ABCG2的rs2231142位點基因多態(tài)性與大劑量MTX化療毒性反應(yīng)腎功能損傷相關(guān)，但與預后關(guān)系不大。但本研究也存在一定的局限性，如在MTX轉(zhuǎn)運途徑中僅選擇ABCG2基因的外向轉(zhuǎn)運蛋白進行分析，未包括其他內(nèi)向和外向蛋白；樣本量有限等。