王建峰 陸士蛟 劉俊 王彭 王倩倩 陳杰

消化道運動受外來神經(jīng)和內(nèi)在神經(jīng)（腸神經(jīng)）的調控。在生理條件下，腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system,ENS）對胃腸運動起主要調節(jié)作用。ENS支配平滑肌運動不像骨骼肌那樣形成神經(jīng)肌-接頭的突觸聯(lián)系，而是神經(jīng)末梢在平滑肌層內(nèi)形成無數(shù)的曲張體（內(nèi)含神經(jīng)遞質被的囊泡），當神經(jīng)沖動到來的時候，曲張體內(nèi)的神經(jīng)遞質被釋放出來并擴散到平滑肌發(fā)揮作用。近年來研究表明，曲張體與胃腸道平滑肌細胞之間有2種間質細胞，即肌間Caja間質細胞（interstitial cell of Cajal,ICC）和血小板衍生生長因子受體α（platelet-derived growth factor receptor alpha,PDGFRα）陽性細胞[1-4]。平滑肌細胞與這2種間質細胞形成縫隙連接，組成平滑肌、ICC和PDGFRα陽性細胞合胞體，即SIP合胞體[1]。神經(jīng)遞質從曲張體釋放出來后，絕大部分通過肌間ICC和PDGFRα陽性細胞調控平滑肌收縮，只有極少量神經(jīng)遞質直接擴散到平滑肌起作用。結腸運動需要ENS和SIP合胞體的共同協(xié)調配合。ENS由興奮性神經(jīng)元和抑制性神經(jīng)元組成運動神經(jīng)元，包括一氧化氮合酶（NOS）和嘌呤神經(jīng)元，參與調節(jié)結腸運動[5-6]。Mane等[7]報道一氧化氮負責平滑肌的持續(xù)放松，而嘌呤神經(jīng)元負責短暫的放松，這可能在結腸傳輸中起主要作用。此外，結腸移行性復合運動（colonic migrating motor complexes,CMMC）為結腸傳輸?shù)闹饕问?，需要滿足2個條件：（1）膽堿能運動神經(jīng)元的激活和抑制性神經(jīng)遞質（主要是一氧化氮、嘌呤）的釋放，進而作用于SIP合胞體調節(jié)結腸傳輸，其中興奮性乙酰膽堿神經(jīng)元與抑制性的一氧化氮能神經(jīng)元主要作用于ICC[1]，進一步激活或抑制ICC上的鈣激活氯通道蛋白1（anoctamin 1,ANO1）產(chǎn)生起搏電流，并通過縫隙連接對平滑肌進行興奮性調節(jié)[8]。另外，ENS中的嘌呤能神經(jīng)元通過腺嘌呤核苷三磷酸等嘌呤能遞質激活PDGFRα陽性細胞上的鈣激活鉀通道（small conductance Ca2+-activated K+channel,SK3）對平滑肌產(chǎn)生抑制性調節(jié)作用[9]。雖然目前有一些關于ICC和PDGFRα陽性細胞在胃腸道中的定位、細胞形態(tài)及相關功能等方面的研究報道，但多數(shù)集中在小腸和胃，而對于結腸中SIP合胞體的研究較少[10]。因此，本研究擬采用多種實驗方法，主要探討小鼠結腸近遠端中這2種間質細胞及離子通道的分布，以及其誘導平滑肌舒縮的傳導機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選用無特定病原體的C57BL/6J小鼠15只，10～12周齡，雌雄不拘，由上海斯萊克實驗動物公司提供；飼養(yǎng)于上海交通大學實驗動物中心（實驗動物編號：A2016047）。

1.2 試劑與儀器 RIPA蛋白裂解液（規(guī)格：100 ml，批號：p1082）、ECL 蛋白顯色試劑盒（規(guī)格：50 ml，批號：p0013）均購自上海碧云天生物技術有限公司；ANO1抗體（規(guī)格：100 μl，批號：ab191040）、SK3 抗體（規(guī)格：100 μl，批號：ab28631）均購自英國 Abcam 公司；c-Kit抗體（規(guī)格：20 μl，批號：3074）、PDGFRα 抗體（規(guī)格：20 μl，批號：3174）、辣根過氧化物酶標記抗兔二抗（規(guī)格：100 μl，批號：7074）、辣根過氧化物酶標記抗鼠二抗（規(guī)格：100 μl，批號：7076） 均購自美國 CST 公司；GAPDH 抗體（規(guī)格：100 μg，批號：GB11002）購自谷歌生物科技有限公司；NOS抑制劑L-NAME（規(guī)格：1 ml，批號：M00381）購自北京百奧萊博科技有限公司；ANO1通道阻斷劑 NPPB（規(guī)格：10 mg，批號：S81879）購自上海源葉生物科技有限公司；SK3激動劑CyPPA（規(guī)格：10 mg，批號：ab73029）購自英國 Abcam 公司；SK3 阻斷劑 apamin（規(guī)格：1 mg，批號：CP60151）購自美國ChemeGen公司。肌肉張力換能器（型號：JZJ01，量程30 g）及多道生理信號采集處理系統(tǒng)（型號：RM-6240C）購自成都儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 平滑肌組織制備 異氟烷麻醉后頸椎脫臼處死小鼠，迅速取出結腸，放入預先通95% O2+5% CO2混合氣的4℃Krebs平衡溶液中。在解剖顯微鏡下，用眼科剪沿腸系膜方向將腸系膜和脂肪組織清理干凈，并沿著腸系膜剪開整個腸管，腸黏膜向上展開固定；用手術鑷撕去結腸黏膜和黏膜下層，保留完整的平滑肌肌層。

1.3.2 c-Kit、ANO1、PDGFRα、SK3 蛋白表達檢測 （1）采用免疫組化染色法。將甲醛溶液浸泡的小鼠遠近端結腸平滑肌組織進行包埋，常規(guī)石蠟切片，脫蠟后清水清洗，然后置于100℃檸檬酸抗原修復緩沖液（pH 6.0）中20 min進行抗原修復。自然冷卻后浸入3%過氧化氫溶液25 min，PBS充分洗滌。3% BSA封閉2 h后滴加一抗覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。PBS洗3次，5 min/次，二抗室溫孵育50 min；PBS充分洗滌后擦干，上顯色劑，在顯微鏡下觀察，達到信號強度后終止顯色，蘇木精襯染、脫水、透明、封片。（2）采用Western blot法。取小鼠遠近端結腸平滑肌組織，加入預冷的含苯甲基磺酰氟的RIPA蛋白裂解液，轉入勻漿儀中研磨（60 s/次，共3次）。4℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清液，即狹窄段/擴張段組織的總蛋白。加入Loading buffer，置于100℃5 min變性。經(jīng)5%濃縮膠和8%分離膠聚丙烯酰胺凝膠電泳后（每孔的上樣量為20 μg總蛋白）轉至聚偏二氟乙烯膜上，3% FBS封閉1 h后進行免疫抗體反應。使用ECL蛋白顯色試劑盒發(fā)光顯色，并利用Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)曝光。

1.3.3 CMMC檢測 采用電生理學實驗。取小鼠全結腸，待結腸規(guī)律的蠕動波出現(xiàn)后，分別加入NOS抑制劑L-NAME（100 μM）、ANO1 通道阻斷劑 NPPB（5 μM）、SK3激動劑CyPPA（300nM）、SK3阻斷劑apamin（300nM），檢測給藥前后CMCC。將結腸放入預先通混合氣的4℃Krebs平衡溶液中。在解剖顯微鏡下，用眼科剪沿腸系膜方向小心地將腸系膜和脂肪組織清理干凈，輕柔拉直結腸并用小細針固定結腸兩端。使用1 ml注射器連接軟膠管吸取Krebs溶液，將腸道內(nèi)容物打散、沖出，反復操作，直至糞便全部排出。中空的小鐵球（用于模擬糞便顆粒）插入微細玻璃管，并將玻璃管與小球由近端向遠端插入結腸中。Krebs平衡溶液灌流，恒溫箱將灌流槽的溫度控制在36～37℃，同時不停輸送混合氣。結腸連同玻璃管放入灌流槽中穩(wěn)定30 min左右。2根5/0絲線一端通過生物膠分別粘在近端和遠端結腸的腸壁上，一端連接肌肉張力換能器。約30 min后旋轉肌肉張力換能器旋鈕，給予0.3 g張力。打開多道生理信號采集處理系統(tǒng)，記錄AUC（即時間和收縮幅度的積分，表示整體收縮強度），計算加藥前后500 s波形的AUC變化率。

1.3.4 平滑肌自發(fā)性收縮檢測 采用電生理學實驗。將平滑肌肌層沿著環(huán)形肌的方向剪成2 mm×4 mm大小的肌條，用4-0絲線系住兩端，并打大小合適的空心結，實驗過程中盡量避免對結腸組織進行不必要的鉗夾與牽拉。分別加入 NOS 抑制劑 L-NAME（100 μM）、ANO1 通道阻斷劑 NPPB（5 μM）、SK3 激動劑 CyPPA（300 nM）、SK3阻斷劑apamin（300 nM），檢測給藥前后平滑肌自發(fā)性收縮。將結腸平滑肌肌條一端垂直且無張力懸浮固定于盛有10 ml 37℃Krebs平衡溶液的單腔器官浴槽中并連續(xù)通混合氣，另一端用絲線固定于肌肉張力換能器（連接多道生理信號采集處理系統(tǒng)）上。肌條在單腔器官浴槽內(nèi)每隔20 min更新Krebs平衡溶液，平衡30 min后給予初始張力0.3 g，待肌條出現(xiàn)自發(fā)性收縮且平穩(wěn)后，加入通道激動劑或阻斷劑，觀察15 min并記錄AUC，計算加藥前后500 s波形的AUC變化率。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用Origin數(shù)據(jù)分析軟件。計量資料以表示，組間比較采用配對樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠近遠端結腸平滑肌組織中c-Kit、ANO1蛋白表達比較 小鼠近端結腸平滑肌組織中c-Kit、ANO1蛋白表達分別為 3.24±0.45、1.73±0.35，均明顯高于遠端結腸的 1.79±0.26、1.34±0.15，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖 1（插頁）。

2.2 L-NAME、NPPB對小鼠近遠端CMCC和平滑肌自發(fā)性收縮的影響 L-NAME給藥后，結腸蠕動明顯增加，平滑肌自發(fā)性收縮增強；近端CMCC增加至給藥前的（158.7±6.5）%，平滑肌自發(fā)性收縮增強至（137.9±3.9）%；遠端CMCC 增加至（114.6±7.6）%，平滑肌自發(fā)性收縮增強至（119.5±4.1）%，見圖2a-d。NPPB 阻斷 ANO1通道后，近遠端CMMC明顯被抑制，近端CMCC降低至給藥前的（46.2±1.8）%，平滑肌自發(fā)性收縮降低至（48.9±6.7）%；遠端 CMCC 降低至（84.2±2.9）%，平滑肌自發(fā)性收縮降低至（66.5±3.9）%，見圖 2e-h。

圖2 L-NAME、NPPB對小鼠近遠端CMCC和平滑肌自發(fā)性收縮的影響（a-d：L-NAME給藥前后；e-h：NPPB給藥前后；與加藥前比較，*P＜0.05；加藥后近遠端比較，△P＜0.05；CMCC為結腸移行性復合運動）

2.3 小鼠近遠端結腸平滑肌組織中PDGFRα、SK3蛋白表達比較 小鼠近端結腸平滑肌組織中PDGFRα、SK3 蛋白表達分別為 0.68±0.09、0.35±0.08，均明顯低于遠端結腸的 1.28±0.93、1.50±0.25，差異均有統(tǒng)計學意義（均 P＜0.05），見圖 3（插頁）。

2.4 CyPPA、apamin對小鼠近遠端CMCC和平滑肌自發(fā)性收縮的影響 CyPPA給藥后，小鼠近遠端CMMC被明顯抑制；近端CMCC降低至給藥前的（91.9±2.7）%，平滑肌自發(fā)性收縮降低至（55.2±5.7）%；遠端CMCC降低至（79.7±2.2）%，平滑肌自發(fā)性收縮降低至（33.3±3.2）%，見圖4a-d。apamin阻斷SK3后，近遠端CMMC均明顯增強，近端CMCC增強至給藥前的（106.2±7.7）%，平滑肌自發(fā)性收縮增強至（123.9±5.9）%；遠端CMCC增強至（110.7±3.6）%，平滑肌自發(fā)性收縮增強至（147.5±6.8）%，見圖4e-h。

圖4 CyPPA、apamin對小鼠近遠端CMCC和平滑肌自發(fā)性收縮的影響（a-d：CyPPA給藥前后；e-h：apamin給藥前后；與加藥前比較，*P＜0.05；加藥后近遠端比較，△P＜0.05；CMCC為結腸移行性復合運動）

3 討論

20世紀70年代末基于電生理學和超微結構的觀察，ICC最初被認為是起搏細胞[10-14]。在過去幾年里，ICC的起搏器功能和ENS網(wǎng)絡被認為是結腸運輸中的獨立系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，結腸中的起搏器網(wǎng)絡由肌間神經(jīng)叢ICC和肌間ICC組成，且該網(wǎng)絡通過肌間ICC中的膽堿能KV7.5通道抑制激活[15]。ICC的起搏器功能和ENS網(wǎng)絡的協(xié)同作用在結腸傳輸過程中被證實。有關ICC順序運作的轉運機制認為，ICC不僅是消化道平滑肌自律性運動的起搏細胞，同時還介導神經(jīng)信號的傳遞。ICC胞內(nèi)IP3介導的ANO1通道產(chǎn)生自發(fā)的瞬間內(nèi)向電流，引起ICC自發(fā)的瞬間去極化，進而引起胞膜上電壓依賴性鈣通道的開放，使胞外Ca2+內(nèi)流，產(chǎn)生慢波[16]。2012年Koh等[17]首先在消化道平滑肌興奮性的研究中提出SIP合胞體（平滑肌/ICC/PDGFRα陽性細胞）的概念。隨后關于PDGFRα陽性細胞在平滑肌功能中的作用成為研究熱點。研究表明，在SIP合胞體中，PDGFRα陽性細胞起抑制性作用，嘌呤能抑制性神經(jīng)遞質作用于PDGFRα陽性細胞上的P2Y1受體[3，18]，同樣激活PLC/IP3信號通路，激活SK3產(chǎn)生自發(fā)的瞬時外向電流，鉀離子外流引起PDGFRα陽性細胞超極化，進而通過PDGFRα陽性細胞與平滑肌細胞之間的縫隙連接引起平滑肌細胞超極化[19-20]。因此認為胃腸道平滑肌的節(jié)律性收縮是外來神經(jīng)、腸內(nèi)神經(jīng)叢與SIP合胞體共同協(xié)調作用的結果[9]。事實上，結腸具有多種運動模式，如CMMC、節(jié)段性活動、蠕動、張力性抑制等[8，21]。根據(jù)文獻可知，小鼠結腸推進糞粒的速度與CMMC的傳導速度相同，這表明CMMC是糞便推進的主要動力形式[22]。但無論傳播形式如何，都有必要產(chǎn)生壓力梯度，以確保糞便從結腸近端推進至遠端。因此，為了進一步了解結腸傳輸動力的形成機制，筆者利用小鼠結腸標本研究SIP合胞體在結腸近遠端的分布，并從功能上研究其內(nèi)在傳導機制。

本研究首先利用免疫組化染色、Western blot法檢測SIP合胞體在結腸近遠端的分布及特異性蛋白表達情況，結果發(fā)現(xiàn)在小鼠近端結腸ICC分布多于遠端結腸，其中小鼠結腸平滑肌組織中c-Kit、ANO1蛋白在近端結腸的表達高于遠端結腸；PDGFRα陽性細胞在小鼠遠端結腸分布多于近端結腸，其中小鼠遠端結腸平滑肌組織PDGFRα、SK3蛋白表達明顯高于近端結腸。進一步作與CMMC實驗和平滑肌肌條收縮實驗，將正常小鼠整段結腸、平滑肌肌條放入水浴槽孵育一段時間，待出現(xiàn)并保持規(guī)律的蠕動波、收縮波后，加入L-NAME阻斷一氧化氮的合成，記錄到近端結腸CMMC和平滑肌自發(fā)性收縮的頻率較遠端結腸明顯增強；加入ANO1通道阻斷劑NPPB后，近端結腸CMMC和平滑肌自發(fā)性收縮的藥物抑制作用較遠端結腸更強；加入SK3激動劑CyPPA后，結腸平滑肌自發(fā)性收縮明顯減弱，CMMC受到明顯抑制，其中遠端結腸的CMMC和肌條收縮對SK3激動劑CyPPA更加敏感；加入SK3阻斷劑apamin后，結腸平滑肌自發(fā)性收縮和CMMC明顯增強，同樣遠端結腸對apamin的作用更加敏感。以上實驗結果提示，從小鼠近端結腸到遠端結腸，PDGFRα陽性細胞呈遞增性分布，在生理條件下ENS中的一氧化氮能抑制性神經(jīng)通過一氧化氮作用于ICC，使CMMC頻率保持合理的范圍，維持正常的結腸傳輸功能。同時，筆者推測在ENS中，抑制性神經(jīng)元在結腸自發(fā)性收縮中起主導作用。

綜上所述，筆者推測在小鼠結腸SIP合胞體中，2種間質細胞ICC和PDGFRα陽性細胞呈規(guī)律性分布，即結腸近端到遠端ICC分布呈遞減性分布，而PDGFRα陽性細胞分布呈遞增性分布，ICC和PDGFRα陽性細胞在結腸近遠端的分布梯度與結腸近遠端動力模式一致，使得結腸收縮時能形成結腸傳輸動力的有效梯度，即近端傳輸動力最強而遠端最弱，從而保證糞便從近端結腸向遠端結腸順利排出。SIP合胞體中2種間質細胞的分布及其在結腸動力形成中的初步機制研究結果，可能為胃腸動力障礙性疾病的診治提供新的思路和新的治療靶點。