涂文輝， 劉 錦， 朱傳武

1 蘇州大學(xué)附屬傳染病醫(yī)院， 蘇州市第五人民醫(yī)院 肝病科， 江蘇 蘇州 215131；

2 浙江省臺(tái)州市立醫(yī)院 感染科, 浙江 臺(tái)州 318000

HBV是目前已知感染人類最小的DNA病毒，大小為42 nm，基因組全長(zhǎng)為3.2 kb，包含S、C、P、X 4個(gè)開(kāi)放讀碼框架。病毒以共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)為模板，采用宿主DNA依賴的RNA聚合酶，轉(zhuǎn)錄5種不同的mRNA，分別是3.5 kb的pgRNA、preC mRNA，2.4 kb、2.1 kb的preS/S mRNA和0.7 kb的HBx mRNA。pgRNA作為遺傳物質(zhì)包裹入核心顆粒，逆轉(zhuǎn)錄合成部分雙鏈DNA基因組，并翻譯病毒聚合酶蛋白(Pol)；preC mRNA翻譯出前C/C蛋白，進(jìn)一步修飾后形成HBeAg、HBcAg；preS/S mRNA使用不同的起始密碼子，翻譯出3種包膜蛋白，分別是大蛋白(preS1+preS2+S)、中蛋白(preS2+S)和小蛋白(S)；HBx mRNA翻譯乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)[1]。

蛋白質(zhì)泛素化是蛋白翻譯后的一種修飾，在細(xì)胞內(nèi)廣泛存在。細(xì)胞內(nèi)80%～90%的蛋白質(zhì)可以被泛素化系統(tǒng)識(shí)別和修飾[2]。蛋白質(zhì)的泛素化由泛素蛋白酶體系統(tǒng)精密調(diào)控。泛素蛋白酶體系統(tǒng)由泛素、泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme, E1)、泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzyme, E2)、泛素連接酶(ubiquitin ligase, E3)，以及26S蛋白酶體組成。泛素化過(guò)程大致為：E1首先以ATP依賴的方式與泛素結(jié)合，接下來(lái)泛素被轉(zhuǎn)移到E2上；E3與蛋白底物相互作用，并將E2上的泛素轉(zhuǎn)移至蛋白底物上，最終泛素化的底物進(jìn)入26S蛋白酶體中進(jìn)行降解[3]。E3在抗病毒天然免疫信號(hào)的各個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，過(guò)程詳見(jiàn)圖1[4]。

1 S基因編碼蛋白

1.1 HBsAg相互作用蛋白 HBsAg是HBV包膜蛋白的主要成分，包括L(大蛋白)、M(中蛋白)、S(小蛋白)3種蛋白，HBV依賴L蛋白中小肽段與靶細(xì)胞的鈉離子-?；撬峁厕D(zhuǎn)運(yùn)多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)受體結(jié)合；L蛋白還具有病毒復(fù)制中的調(diào)節(jié)作用；M蛋白主要是裝配病毒顆粒。外膜蛋白攜帶B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞表位，給宿主提供保護(hù)性免疫的免疫源。目前，關(guān)于HBsAg與細(xì)胞蛋白之間的相互作用還知之甚少，Toh等[5]利用酵母分裂泛素系統(tǒng)，分離了很多細(xì)胞膜蛋白，其中包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的駐留蛋白(硫氧化還原蛋白相關(guān)跨膜蛋白2)、參與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞和HIV介導(dǎo)的CD4下調(diào)的銜接蛋白、柯薩奇B病毒的共同受體等，這些蛋白均與HBsAg存在相互作用。

Hartmann-Stühler等[6]利用L蛋白-特異性前S1結(jié)構(gòu)域作為誘餌，啟動(dòng)了一個(gè)雙雜交篩選。通過(guò)這種方法，證實(shí)了γ2銜接蛋白是網(wǎng)格蛋白銜接蛋白的成員之一，負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的分類和運(yùn)輸，是L蛋白特異性的結(jié)合對(duì)象。親和層析和免疫共沉淀證實(shí)了L蛋白和γ2銜接蛋白之間存在相互作用的證據(jù)，并且確認(rèn)了結(jié)合位點(diǎn)位于L蛋白特異的前S1結(jié)構(gòu)域和γ2銜接蛋白特異的耳部結(jié)構(gòu)域。有趣的是，兩者在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的共同表達(dá)，導(dǎo)致L蛋白和γ2銜接蛋白在高爾基體上聚集，因此研究強(qiáng)烈支持兩種蛋白存在生理上的關(guān)聯(lián)。

1.2 HBsAg降解途徑 為了探索HBV包膜蛋白的降解途徑，有研究[7]觀察了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制系統(tǒng)對(duì)M蛋白的監(jiān)測(cè)和分泌功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型M蛋白以及分泌功能不全的M蛋白突變體可以從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有效地逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，通過(guò)與泛素化無(wú)關(guān)的胞質(zhì)蛋白酶體途徑降解。并且，該泛素非依賴途徑與抗原遞呈無(wú)關(guān)，因?yàn)闊o(wú)論是野生型還是突變型M蛋白，都難以通過(guò)MHC-Ⅰ遞呈。通過(guò)添加兩個(gè)賴氨酸殘基，可增加泛素化并導(dǎo)致抗原遞呈增加。Liu等[8]以HBV M蛋白為模型，發(fā)現(xiàn)了一種新的、不依賴泛素化的蛋白酶體依賴性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途徑。在HBV感染的過(guò)程中，病毒可能會(huì)利用該途徑限制抗原遞呈。

利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)葡萄糖苷酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，研究者發(fā)現(xiàn)在產(chǎn)生HBV包膜糖蛋白的組織培養(yǎng)中，L蛋白和M蛋白的糖基化和非糖基化形式的數(shù)量都大大減少；相反，S蛋白沒(méi)有受到影響。L蛋白和M蛋白分泌的減少可能是由蛋白酶體降解途徑介導(dǎo)的，而在具有功能性葡萄糖苷酶的細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到L蛋白和M蛋白的蛋白酶體降解[9]。

2 C基因編碼蛋白

2.1 HBcAg相關(guān)泛素連接酶 HBcAg是病毒核衣殼的主要成分，是參與包裝RNA、反轉(zhuǎn)錄、病毒裝配和釋放的多功能蛋白。HBV在感染細(xì)胞的出芽分泌過(guò)程中，可能使用細(xì)胞γ2-銜接蛋白和泛素連接酶Nedd4，通過(guò)與泛素結(jié)合以協(xié)調(diào)其組裝和釋放[10]。此前已有研究[6]發(fā)現(xiàn)γ2-銜接蛋白和HBV L蛋白之間存在相互作用。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)，同樣的γ2-銜接蛋白和病毒核衣殼也存在相互作用，可以通過(guò)破壞HBV/γ2-銜接蛋白的相互作用，抑制病毒的產(chǎn)生。突變分析揭示：γ2-銜接蛋白的泛素結(jié)合活性存在特定的泛素作用基序，可以與核衣殼發(fā)生相互作用。HBcAg含有兩個(gè)賴氨酸殘基(K7和K96)，K96位是一個(gè)潛在的泛素化靶點(diǎn)，對(duì)γ2-銜接蛋白的識(shí)別和病毒的產(chǎn)生是必不可少的。核衣殼通過(guò)其晚期結(jié)構(gòu)域樣PPAY序列，與核內(nèi)Nedd4相互作用，提示了細(xì)胞泛素系統(tǒng)參與HBV組裝。過(guò)表達(dá)無(wú)催化活性的Nedd4突變體可以降低HBV的釋放，表明蛋白質(zhì)泛素化在功能上參與了HBV的產(chǎn)生[11]。另一項(xiàng)研究[12]表明，在轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系中，HBcAg泛素化主要發(fā)生在賴氨酸殘基K7上，通過(guò)K29位泛素化進(jìn)行翻譯后修飾。

Np95/ICBP90樣環(huán)指蛋白(Np95/ICBP90-like RING finger protein，NIRF)具有自身泛素化活性，是泛素連接酶的標(biāo)志。泛素連接酶NIRF與HBcAg結(jié)合，導(dǎo)致蛋白酶體介導(dǎo)的HBcAg降解。NIRF下調(diào)HBcAg蛋白水平，導(dǎo)致HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBV顆粒減少。敲除NIRF，則顯著增加內(nèi)源性HBcAg蛋白水平，導(dǎo)致HBV釋放[13]。研究結(jié)果表明，NIRF與HBcAg的相互作用，促進(jìn)HBcAg在體內(nèi)的降解。NIRF介導(dǎo)的泛素-蛋白酶體途徑通過(guò)控制HBcAg水平，影響HBV顆粒的釋放，提示NIRF可能參與HBV的成熟。還有研究探討了NIRF對(duì)HBV復(fù)制的影響及其機(jī)制，證明NIRF抑制了轉(zhuǎn)染pAAV-HBV1.3的HepG2細(xì)胞中HBV DNA的復(fù)制和HBsAg、HBeAg的分泌。在表達(dá)HBV的小鼠模型中，NIRF也抑制HBV的復(fù)制和分泌。NIRF還降低了HBV cccDNA結(jié)合的H3組蛋白的乙?；痆14]，cccDNA的活性在體內(nèi)和體外均受到組蛋白H3乙?；癄顟B(tài)改變的調(diào)控，進(jìn)而影響其轉(zhuǎn)錄和HBV的復(fù)制。表明NIRF不僅通過(guò)與HBcAg的直接作用參與HBV的復(fù)制，而且通過(guò)降低與HBV cccDNA結(jié)合的H3組蛋白的乙?；{(diào)控HBV的復(fù)制。

2.2 HBcAg的泛素化與免疫增強(qiáng) 泛素是一種高度保守的小分子調(diào)控蛋白，其介導(dǎo)的抗原處理快速且高效，并刺激細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。因此，泛素介導(dǎo)的抗原處理已廣泛應(yīng)用于慢性感染和癌癥研究，以提高免疫應(yīng)答。重組pUb-HBcAg DNA疫苗誘導(dǎo)免疫BALB/c小鼠產(chǎn)生特異性抗-HBc反應(yīng)和特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)，表明泛素可以作為一種分子佐劑來(lái)提高DNA疫苗的效力[15-16]。

慢性HBV感染的特點(diǎn)是輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)1型細(xì)胞免疫和特異性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的功能受損。轉(zhuǎn)染了泛素-HBcAg的慢病毒能夠有效誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟，成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞有效誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為T(mén)h1，并產(chǎn)生HBcAg特異性CTL，增加抗原特異性CD8+/IFNγ+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量[17]。胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽(cytoplasmic transduction peptide，CTP)源自人類免疫缺陷病毒1轉(zhuǎn)錄蛋白反式激活體的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域，能夠有效地將生物分子傳遞到細(xì)胞質(zhì)中。利用CTP的細(xì)胞穿透特性，泛素-HBcAg-CTP融合蛋白能夠直接滲透到樹(shù)突狀細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。融合蛋白不僅增加了樹(shù)突狀細(xì)胞表面分子的表達(dá)和T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌，而且誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞分化為特異性CTL，增強(qiáng)了抗病毒能力[18]。融合蛋白引起特異性CTL活性增強(qiáng)，降低了HBsAg和HBV DNA血清水平，降低了HBsAg和HBcAg在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟組織中的表達(dá)，提示具有治療方面的價(jià)值[19]。泛素-HBcAg-CTP融合蛋白還能上調(diào)T淋巴細(xì)胞中Jak2、Tyk2、STAT1和STAT4的表達(dá)[20]。

2.3 HBeAg與泛素連接酶的相互作用 HBeAg是調(diào)節(jié)免疫的功能蛋白，也是病毒高水平復(fù)制的標(biāo)志。HBeAg可干擾NF-κB活性，進(jìn)而導(dǎo)致高病毒載量。Wang等[21]研究了HBeAg抑制IL-1β刺激的NF-κB活性，結(jié)果表明，HBeAg可以與NF-κB必須調(diào)節(jié)蛋白(NF-κB essential modulator，NEMO)作用。NEMO是一種與IκB激酶相關(guān)的調(diào)節(jié)亞基，調(diào)節(jié)NF-κB的激活。HBeAg抑制IL-1β誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor associated factor 6，TRAF6)依賴性K63相關(guān)泛素化的NEMO，從而下調(diào)NF-κB活性，促進(jìn)病毒復(fù)制及持續(xù)性感染。研究者通過(guò)原代人肝細(xì)胞，HBV感染的HepG2-NTCP細(xì)胞和臨床肝臟樣本研究，進(jìn)一步證明了HBeAg對(duì)NF-κB信號(hào)通路的抑制作用。

3 P基因編碼蛋白

3.1 Pol蛋白相關(guān)泛素連接酶 Pol蛋白是一種決定病毒復(fù)制活性的聚合酶蛋白：末端蛋白是反轉(zhuǎn)錄負(fù)鏈DNA的引物；聚合酶激活pgRNA反轉(zhuǎn)錄DNA鏈；RNA酶H清除RNA-DNA雜交鏈中的RNA，合成正鏈DNA。在接受伊馬替尼(imatinib)(一種Abl激酶抑制劑)或硼替佐米(bortezomib)(一種蛋白酶體抑制劑)治療的患者中，經(jīng)常有HBV再激活的報(bào)道，但這種重新激活的潛在機(jī)制尚不清楚。Hou等[22]報(bào)道Pol蛋白經(jīng)Cdt2招募到Cullin-RING連接酶4(Cullin-RING ligase 4，CRL4)，從而進(jìn)行泛素化和蛋白酶體降解，這一過(guò)程是由c-Abl非受體酪氨酸激酶激發(fā)的。伊馬替尼和硼替佐米可穩(wěn)定病毒Pol蛋白，增加HBV感染細(xì)胞中的病毒載量，因此，這可以從機(jī)制上解釋以上兩種藥物激活患者的HBV復(fù)制。

細(xì)胞凋亡抑制蛋白2(cellular inhibitor of apoptosis protein 2，cIAP2)屬于凋亡抑制劑(IAP)家族，是一種有效的細(xì)胞死亡抑制劑，cIAP2具有羧基末端的RING指結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有介導(dǎo)蛋白質(zhì)泛素化的泛素連接酶活性。使用cDNA微陣列篩選腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的細(xì)胞基因，具有強(qiáng)烈上調(diào)cIAP2抗HBV的活性[23]。進(jìn)一步研究[24]證明，cIAP2可以顯著降低HBV DNA復(fù)制中間體的水平，但不能降低總病毒RNA或核心蛋白的水平。Pol蛋白是cIAP2的靶標(biāo)，過(guò)表達(dá)cIAP2可以降低Pol蛋白水平，而過(guò)表達(dá)cIAP2的E3連接酶缺陷型突變體(稱為cIAP2*)則不能。進(jìn)一步研究表明，cIAP2可以與Pol蛋白結(jié)合，促進(jìn)其多聚泛素化，通過(guò)蛋白酶體途徑進(jìn)行降解。

三結(jié)構(gòu)域(tripartite motif，TRIM)家族是一個(gè)新的E3連接酶家族，研究表明，某些TRIM蛋白具有抗HBV復(fù)制的活性，例如TRIM14，一種Ⅰ型干擾素(IFN)刺激基因，通過(guò)靶向HBx來(lái)控制HBV的復(fù)制；TRIM22，可抑制HBV核心啟動(dòng)子的活性而影響HBV復(fù)制；以及TRIM25，可通過(guò)IL-27抑制HBV復(fù)制。Mu等[25]發(fā)現(xiàn)，SPRY域負(fù)責(zé)TRIM21與HBV Pol蛋白之間的相互作用，Pol蛋白的TP域與TRIM21相互作用。研究者使用在線工具預(yù)測(cè)了潛在的Pol蛋白泛素化位點(diǎn)，通過(guò)對(duì)Pol蛋白間隔區(qū)中的K260和K283點(diǎn)突變，證實(shí)是Pol蛋白泛素化的賴氨酸位點(diǎn)。TRIM21介導(dǎo)了Pol蛋白K48位多聚泛素化，導(dǎo)致其通過(guò)泛素蛋白酶體途徑降解。

3.2 Pol蛋白通過(guò)泛素化途徑影響其他蛋白的穩(wěn)定性 視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ(retinoic acid inducible gene Ⅰ，RIG Ⅰ)介導(dǎo)產(chǎn)生的IFN能夠被HBV抑制。HBV明顯干擾IFNβ的產(chǎn)生和STING介導(dǎo)的抗病毒免疫，STING已被證實(shí)為外源DNA識(shí)別和抗病毒天然免疫的核心因素。篩選分析表明，HBV Pol蛋白能夠抑制STING激活干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)和誘導(dǎo)IFNβ。在不改變STING表達(dá)水平的情況下，Pol蛋白被證明與STING存在物理聯(lián)系，其逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)域可以顯著降低STING的K63位多聚泛素化，在抑制IFNβ的產(chǎn)生方面發(fā)揮作用，這可能是HBV對(duì)抗天然免疫的一種新機(jī)制[26]。

4 X基因編碼蛋白

4.1 HBx與蛋白酶體相互作用 HBx是一種多功能的調(diào)節(jié)因子，已知能激活轉(zhuǎn)錄、影響DNA修復(fù)、調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和死亡。HBx蛋白在病毒復(fù)制、肝細(xì)胞癌變和激活某些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑方面十分重要。研究表明HBx是蛋白酶體的抑制劑。通過(guò)免疫共沉淀和蔗糖梯度離心共定位研究，發(fā)現(xiàn)HBx與26S蛋白酶體復(fù)合物存在關(guān)聯(lián)[27]。HBx在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致蛋白酶體的糜蛋白酶和類胰蛋白酶活性降低，泛素化溶菌酶水解也減少。通過(guò)雜交和免疫沉淀法，檢測(cè)到HBx與蛋白酶體的PSMC1(S4 ATP酶)和PSMA7(α1/C2)亞基存在相互作用，并在蔗糖梯度離心時(shí)與蛋白酶體共沉積。另有研究[28]證實(shí)染色質(zhì)重構(gòu)因子BAF155是HBx的綁定伙伴之一。BAF155通過(guò)與20S蛋白酶體亞基PSMA7競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HBx，使HBx免受泛素非依賴性蛋白酶體降解。

4.2 HBx降解相關(guān)泛素連接酶 Zhang等[29]開(kāi)發(fā)了一種針對(duì)HBx的細(xì)胞穿透性全分子抗體(9D11-Tat)。內(nèi)化的9D11-Tat抗體可通過(guò)Fc結(jié)合受體TRIM21介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解，顯著降低細(xì)胞內(nèi)HBx，促進(jìn)了宿主細(xì)胞的抗病毒狀態(tài)。泛素連接酶Siah-1可以靶向HBx進(jìn)行多泛素化和蛋白酶體降解，并減弱HBx的轉(zhuǎn)錄活性[30]。在HepG2細(xì)胞中，敲除p53基因可以下調(diào)Siah-1水平，隨后可見(jiàn)HBx水平上調(diào)[31]。而在Hep3B細(xì)胞中，異常表達(dá)的p53基因上調(diào)了Siah-1水平，同時(shí)可見(jiàn)HBx水平下調(diào)。HBx通過(guò)一個(gè)涉及p53和Siah-1的負(fù)反饋回路調(diào)節(jié)自身的蛋白水平，以控制HBV的復(fù)制。MARCH5是一種線粒體泛素連接酶，其高表達(dá)與肝癌患者生存率的提高有關(guān)[32]。MARCH5與在線粒體中聚集的HBx蛋白相互作用，并將其靶向降解。在MARCH5高表達(dá)的情況下，HBx誘導(dǎo)的活性氧自由基、線粒體自噬和環(huán)氧合酶-2基因表達(dá)受到抑制。

4.3 HBx通過(guò)E3泛素連接酶影響其他蛋白質(zhì) 在HBx的凋亡與泛素化研究[33]中，發(fā)現(xiàn)HBx能夠增強(qiáng)肝細(xì)胞對(duì)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的敏感性，其敏感性的增加與HBx誘導(dǎo)miR-125a上調(diào)有關(guān)，而miR-125a又抑制了其靶基因A20泛素連接酶的表達(dá)。在肝細(xì)胞中拮抗miR-125a或外源性表達(dá)A20，可消除HBx的促凋亡作用。原癌基因垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因1(pituitary tumor transforming gene1，PTTG1)在肝細(xì)胞癌中呈高表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)[34]表明，HBx誘導(dǎo)PTTG1蛋白顯著積累。HBx與PTTG1和/或Skp1-Cul1-F-box泛素連接酶復(fù)合物(Skp1-Cul1-F-box protein，SCF)的蛋白-蛋白相互作用，導(dǎo)致PTTG1與SCF之間的作用被部分破壞，阻礙其經(jīng)蛋白酶體的降解。HBx介導(dǎo)Myc的穩(wěn)定表達(dá)在病毒致癌中起著重要作用。Myc癌蛋白的穩(wěn)定性受SCF泛素連接酶的調(diào)控，特別是其中的SCFSkp2或SCFFbw7泛素連接酶。通過(guò)免疫共沉淀和免疫熒光實(shí)驗(yàn)，揭示了HBx與Myc蛋白存在相互作用，進(jìn)一步分析表明，HBx通過(guò)阻斷Skp2穩(wěn)定Myc癌蛋白[35]。

4.4 HBx的多重功能 HBx通過(guò)與宿主細(xì)胞胞質(zhì)和胞核中的多種蛋白質(zhì)相互作用以執(zhí)行多方面的功能。HBx與損傷特異性DNA損傷結(jié)合蛋白1(DNA damage-binding protein 1，DDB1)的結(jié)合對(duì)于HBx激活HBV轉(zhuǎn)錄是至關(guān)重要的。DDB1與CUL4形成泛素連接酶，并與DDB1 cullin相關(guān)因子的銜接子亞基結(jié)合，靶向泛素化底物，在DNA修復(fù)、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用。HBx被稱為HBV復(fù)制的中樞調(diào)節(jié)因子，通過(guò)H-box基序與CUL4-DDB1泛素連接酶相互作用[36]。HBx在不同的CUL4-DDB1復(fù)合物背景中，以正向和負(fù)向的方式調(diào)節(jié)DDB1的功能，在HBV復(fù)制周期中起著不同的作用。

除TANK結(jié)合激酶1(TANK-binding kinase 1，TBK1)以外，HBx作為一種去泛素化酶能夠從多種蛋白質(zhì)中切割賴氨酸63連接的多泛素鏈，結(jié)合和解偶聯(lián)RIG Ⅰ及TRAF3，導(dǎo)致它們從下游的銜接蛋白CARDIF或TBK1激酶上分離。除RIG Ⅰ和TRAF3外，HBx還與CARDIF、TRIF、NEMO、TBK1、B淋巴細(xì)胞kappa輕鏈多肽基因增強(qiáng)子抑制劑、epsilon激酶(IKKi)和IRF3相互作用。HBx可以靶向多個(gè)信號(hào)通路點(diǎn)，負(fù)調(diào)控Ⅰ型IFN的產(chǎn)生。MAVS是病毒激活信號(hào)通路的重要組成部分，激活NF-κB和IRF3誘導(dǎo)Ⅰ型IFN的產(chǎn)生[37]。HBx與MAVS相互作用，通過(guò)MAVS蛋白中的136位賴氨酸泛素化促進(jìn)MAVS的降解，從而阻止誘導(dǎo)IFNβ[38]。HBx介導(dǎo)的發(fā)病機(jī)理中與泛素蛋白酶體系統(tǒng)有關(guān)的機(jī)制詳見(jiàn)圖2[39]。

5 與HBV cccDNA相關(guān)的泛素化研究

5.1 UBE2L3誘導(dǎo)降解載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽3A(APOBEC3A)維持cccDNA的穩(wěn)定 HBV cccDNA是編碼所有HBV RNA的唯一模板，是導(dǎo)致病毒持續(xù)感染和復(fù)發(fā)的主要原因，清除HBV cccDNA是根治HBV持續(xù)感染的關(guān)鍵[40]。SNP rs59391722位于UBE2L3基因的啟動(dòng)子區(qū)域，該基因編碼E2泛素結(jié)合酶，也稱為UbcH7。全基因組關(guān)聯(lián)研究證實(shí)，UBE2L3基因與成人慢性HBV感染的易感性增加有關(guān)。在兒童HBV感染者中，血清UBE2L3蛋白水平與HBV載量和HBeAg水平呈正相關(guān)。在HBV感染的HepG2-NTCP和人原代肝細(xì)胞中，UBE2L3基因敲低顯著降低總HBV RNA、3.5 kb RNA以及cccDNA的水平。研究其機(jī)制發(fā)現(xiàn)，UBE2L3通過(guò)誘導(dǎo)蛋白酶體依賴性途徑降解APOBEC3A以維持HBV cccDNA的穩(wěn)定，而APOBEC3A主要負(fù)責(zé)HBV cccDNA的降解。此外，IFNα治療后明顯降低UBE2L3的表達(dá)，而沉默UBE2L3基因則增強(qiáng)了IFNα對(duì)HBV RNA、cccDNA和DNA的抗病毒活性[41]。

5.2 ITCH-NUMB通過(guò)負(fù)調(diào)控Notch信號(hào)通路抑制cccDNA Notch信號(hào)通路活化后，通過(guò)兩次蛋白水解切割(α/γ分泌酶)釋放跨膜受體的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Notch intracellular domain，NICD)，隨后將NICD轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核以調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)。ITCH是一種屬于HECT(homologous to E6-AP carboxyl terminus)家族的泛素連接酶，通過(guò)特異性激活Notch1信號(hào)傳導(dǎo)的泛素，并促進(jìn)NICD的泛素依賴性蛋白酶體降解而對(duì)Notch1信號(hào)進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)。阻斷ITCH和銜接蛋白NUMB后，HBV cccDNA增加。cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)介導(dǎo)HBV cccDNA的轉(zhuǎn)錄，Notch激活CREB/CBP(CREB-binding protein)對(duì)HBV cccDNA的產(chǎn)生起關(guān)鍵作用，進(jìn)而觸發(fā)了HBV轉(zhuǎn)錄的激活，上調(diào)泛素連接酶ITCH-NUMB，以泛素依賴性蛋白酶體介導(dǎo)的方式阻斷該途徑，可明顯抑制HBV cccDNA[42]。

5.3 HBx與HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄 肝細(xì)胞核內(nèi)HBV cccDNA的持續(xù)存在，是HBV感染慢性化、抗病毒治療無(wú)法獲得根治，以及停藥后肝炎復(fù)發(fā)的主要原因。因此，HBV cccDNA持續(xù)沉默是慢性乙型肝炎“功能性治愈”的目標(biāo)。病毒蛋白HBx對(duì)HBV cccDNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程發(fā)揮了關(guān)鍵作用。Cheng等[43]以HBx為靶標(biāo)，通過(guò)HiBiT-tagged HBx蛋白檢測(cè)系統(tǒng)，尋找到一個(gè)靶向作用于HBx的小分子化合物——雙香豆素。在HBV感染細(xì)胞模型和人源化肝臟小鼠模型中，雙香豆素均可顯著促進(jìn)HBx蛋白降解，進(jìn)而顯著抑制cccDNA的轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，雙香豆素可作為細(xì)胞煙酰胺腺嘌呤雙核苷酸磷酸鹽(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)醌氧化還原酶抑制劑，解除NADPH醌氧化還原酶對(duì)HBx蛋白的保護(hù)作用，從而促進(jìn)HBx蛋白經(jīng)泛素非依賴的20S蛋白酶體途徑降解。

HBx與CRL4的相互作用對(duì)激活cccDNA基因組的表達(dá)起重要的作用。利用底物捕獲蛋白質(zhì)組學(xué)方法，證實(shí)染色體結(jié)構(gòu)維持復(fù)合物(structural maintenance of chromosome，SMC)蛋白SMC5和SMC6是CRL4HBx的作用底物。在人肝細(xì)胞和人源化小鼠體內(nèi)，HBx表達(dá)和HBV感染對(duì)SMC5/6復(fù)合物有降解作用，后者通過(guò)抑制HBV的基因表達(dá)以限制HBV復(fù)制[44]。HBx靶向SMC5/6是通過(guò)CRL4HBx連接酶泛素化及其后的蛋白酶體降解完成的。SMC5/6基因敲除可以恢復(fù)HBx缺陷型人肝細(xì)胞中HBV的復(fù)制[45]。泛素蛋白酶體系統(tǒng)在HBV生命周期中的更多調(diào)節(jié)作用詳見(jiàn)圖3[39]。

6 總結(jié)與展望

總之，HBV及其相關(guān)蛋白的泛素化研究越來(lái)越受到重視。HBsAg、HBeAg或HBV顆粒已被證明能夠抑制Toll樣受體誘導(dǎo)的抗病毒活性，降低IFNβ及IFN刺激基因的表達(dá)。病毒蛋白的降解伴隨著體液和細(xì)胞免疫功能的恢復(fù)，對(duì)于控制和清除HBV感染具有重要意義。HBsAg的泛素化研究大多局限于蛋白相互作用及蛋白酶體降解，深層次的研究還相當(dāng)缺乏。C基因相關(guān)蛋白的泛素化研究大多集中在構(gòu)建泛素相關(guān)融合蛋白，以此增強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，達(dá)到抗病毒治療的目的。P基因相關(guān)蛋白泛素化研究鑒定了多個(gè)與Pol蛋白降解有關(guān)的泛素連接酶。HBx是目前泛素化研究最多的一種HBV編碼蛋白，它是蛋白酶體抑制劑，也是一種去泛素化酶，因此具有多重身份和功能。近年來(lái)，與HBV cccDNA相關(guān)的泛素化研究也逐漸增加，表明為了治愈慢性HBV感染，研究的領(lǐng)域在不斷地拓展。相信為了實(shí)現(xiàn)世界衛(wèi)生組織2030年消除HBV感染的目標(biāo)，HBV及其相關(guān)蛋白質(zhì)泛素化研究將成為今后關(guān)注和研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：涂文輝、劉錦負(fù)責(zé)文獻(xiàn)查找，資料分析，撰寫(xiě)論文；朱傳武擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。