陳 旋，魯秀才，2，吳 丹，2，楊 延，2

（1.滇西科技師范學(xué)院生物技術(shù)與工程學(xué)院，云南 臨滄 677000；2.云南省紅茶工程技術(shù)研究中心，云南 臨滄 677000）

1 材料與方法

1.1 材料

咖啡種殼：取自云南省臨滄市云縣幸福鎮(zhèn)咖啡廠咖啡豆?jié)穹庸ず蟮目Х葟U棄物，去除種殼中的咖啡豆，密封于4℃冰箱貯藏，其中：粗蛋白（7.31±0.05）%，粗脂肪（2.67±0.04）%，灰分（8.15±0.01）%，水分（8.98±0.08）%，粗纖維（20.44±0.06）%，總糖（18.4±0.05）%。

菌種：釀酒曲（安琪酵母股份有限公司）。

1.2 試劑

無(wú)水乙醇：優(yōu)級(jí)純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

重鉻酸鉀：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司等。

無(wú)水乙醇、重鉻酸鉀：均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

主要儀器設(shè)備：由上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn)的LDZF 50KB-LLL型立式壓力蒸汽滅菌鍋；由上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)的754紫外可見分光光度計(jì)；由上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)的TDL-4型臺(tái)式離心機(jī)；由上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)的HHS型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋；由上海智城分析儀器制造有限公司生產(chǎn)的ZHWY-211D型恒溫培養(yǎng)振蕩器；由上海精科有限公司生產(chǎn)的PHS-3C型pH計(jì)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 稀酸預(yù)處理

稱取10 g咖啡種殼，按液固比8∶1加入3.50%硫酸，在110℃的條件下水解處理90 min，即咖啡種殼稀酸預(yù)處理水解液。

1.4.2 咖啡種殼發(fā)酵培養(yǎng)基

將預(yù)處理后的水解液進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液50 mL置于發(fā)酵瓶中，調(diào)節(jié)pH為5，在115℃的條件下滅菌30 min。

1.4.3 咖啡種殼發(fā)酵乙醇體積分?jǐn)?shù)的測(cè)定

采用重鉻酸鉀氧化分光度法測(cè)定咖啡種殼發(fā)酵液中乙醇的含量。取2 mL發(fā)酵液于離心管中，以3 000 rpm/min轉(zhuǎn)速離心2 min，取上清液1 mL于25 mL試管中，加5%的K2Cr2O7溶液2 mL，沸水浴10 min顯色，迅速冷卻至室溫，加無(wú)菌水定容至10 mL，混合均勻，在590 nm處測(cè)定吸光值。以無(wú)水乙醇為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線求出測(cè)定樣品中乙醇含量。試驗(yàn)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=5.565 2x+0.023 1（R2=0.999 3）。

1.4.4 單因素試驗(yàn)

在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，于咖啡種殼發(fā)酵培養(yǎng)基中接種10%釀酒曲攪拌均勻，溫度為35℃，在80 rmp/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)發(fā)酵。分別考察發(fā)酵時(shí)間為24 h、36 h、48 h、60 h、72 h，接種量為5%、8%、10%、12%、15%，氮源為硫酸銨、磷酸二氫銨、酵母浸粉、蛋白胨、尿素時(shí)，對(duì)咖啡種殼發(fā)酵乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響。

1.4.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取接種量、發(fā)酵時(shí)間、磷酸二氫銨3個(gè)因素，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)咖啡種殼發(fā)酵乙醇的工藝進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素及水平編碼如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平編碼Tab.1 The orthogonal test factors and level codes

1.4.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)處理軟件，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)咖啡種殼發(fā)酵制備乙醇的影響

當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為24 h時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)最大為2.20%，故咖啡種殼發(fā)酵制備乙醇最佳時(shí)間為24 h。

2.1.2 接種量對(duì)咖啡種殼發(fā)酵制備乙醇的影響

接種量是發(fā)酵的基礎(chǔ)，影響發(fā)酵效率和發(fā)酵效果，當(dāng)接種量過(guò)多時(shí)，會(huì)提高發(fā)酵液的黏稠度，且受空間限制，不僅會(huì)減少菌種彼此之間的相互作用，還會(huì)減少發(fā)酵材料的接觸面。同時(shí)，受底物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的限制，接種量過(guò)多會(huì)造成菌種之間的相互競(jìng)爭(zhēng)，大部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于自身的供能，從而大大降低了乙醇的產(chǎn)生。如果接種量太少，底物中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被菌種用于生長(zhǎng)繁殖，使底物中的糖源下降，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)導(dǎo)致乙醇降低。同時(shí)，在發(fā)酵過(guò)程中，接種量的大小會(huì)影響酵母的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響酒精發(fā)酵。結(jié)果如圖1所示，在5%的接種量條件下，乙醇的體積分?jǐn)?shù)最大，為2.41%，故最佳接種量為5%。

圖1 接種量對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響Fig.1 The effect of inoculation amount on ethanol volume fraction

2.1.3 不同氮源對(duì)咖啡種殼發(fā)酵制備乙醇的影響

氮源是生物體核酸、蛋白質(zhì)和其他氮素化合物的構(gòu)成材料。合適的氮源及其濃度，有利于菌種的生成，促進(jìn)代謝產(chǎn)物的合成和分泌。氮源可分為有機(jī)、無(wú)機(jī)，根據(jù)二者組成的復(fù)雜程度以及是否有利于釀酒曲的基本營(yíng)養(yǎng)需求，發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源一般選擇無(wú)機(jī)氮源。最為常見的無(wú)機(jī)氮源有硫酸銨和尿素，本試驗(yàn)選擇硫酸銨、硫酸氫二銨、酵母提取液、蛋白胨、尿素5種氮源作為研究對(duì)象。結(jié)果磷酸氫二銨的乙醇體積分?jǐn)?shù)為3.30%，高于其他氮源，故最源為磷酸氫二銨。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取接種量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）和磷酸氫二銨（C）3個(gè)因素，以乙醇體積分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，采用L9（3）4正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示，各因素對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)影響的主次順序?yàn)锳＞B＞C。通過(guò)方差分析法，咖啡種殼發(fā)酵制備乙醇的最優(yōu)工藝條件為A3B1C1，即接種量為25%，發(fā)酵時(shí)間12 h，磷酸二氫銨為0.1%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The orthogonal test results

由于尿素對(duì)咖啡種殼發(fā)酵制備乙醇的影響最小，以尿素為誤差所在列考慮接種量、發(fā)酵時(shí)間的顯著性，由表3可以看出接種量對(duì)咖啡種殼發(fā)酵制備乙醇的影響顯著。

表3 正交試驗(yàn)方差分析Tab.3 Analysis of variance of orthogonal test

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)方差分析法所得優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為2.80%。故咖啡種殼發(fā)酵制備乙醇的最佳方案為A3B1C1。即接種量為25%，發(fā)酵時(shí)間12 h，磷酸二氫銨為0.1%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以咖啡種殼為原料，通過(guò)對(duì)影響咖啡種殼發(fā)酵制備乙醇的3個(gè)因素（接種量、發(fā)酵時(shí)間、氮源）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定咖啡種殼發(fā)酵制備乙醇最優(yōu)工藝條件是接種量為25%、發(fā)酵時(shí)間12 h、磷酸二氫銨為0.1%，實(shí)際測(cè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)為2.80%。表明選擇設(shè)計(jì)合適的發(fā)酵工藝條件對(duì)提高乙醇含量至關(guān)重要，可為生物質(zhì)能源乙醇的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供相應(yīng)的工藝參數(shù)和理論依據(jù)，同時(shí)也為咖啡加工后廢棄物的綜合利用和深入研究奠定了基礎(chǔ)，避免了資源浪費(fèi)。