王曉敏， 曾 茜， 魏善元， 陳 旭

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所， 貴陽 550006；2.貴州中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院， 貴陽 550025；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)作物品種資源研究所， 貴陽 550006)

靈芝(Ganodermalucidum)是著名的食藥用菌，是我國傳統(tǒng)中藥之一，在我國廣泛栽培[1-2]。目前，國內(nèi)靈芝菌種市場混亂，存在菌種活性退化、品質差等問題[3-4]。栽培過程中由于菌種保藏條件的限制，一些菌種的優(yōu)良性狀無法長期有效保存，或者因為保藏方法成本相對昂貴而不能廣泛應用到生產(chǎn)中[5]。

目前食用菌菌種保存大多采用試管斜面保藏或液氮保藏等方式進行。試管斜面保藏周期短且菌種活性易退化，液氮保藏可較好維持菌種活性，但維護成本高[6]。農(nóng)戶由于缺乏良好的菌種保藏設備，長期依賴購買菌種，增加了栽培成本。因此，探究高效廉價且貼合農(nóng)戶實際生產(chǎn)條件的靈芝菌種保藏方式十分必要。目前，食用菌菌種-20 ℃低溫保藏工藝已在真姬菇等4種食用菌菌種的保藏試驗中進行研究應用。靈芝菌種的-20 ℃低溫保藏缺乏相關研究，-20 ℃低溫保藏法原理類似于液氮超低溫冷藏法，但其保藏成本和對保藏條件的要求遠低于液氮冷藏。通過在凍存管中添加保護劑的方法對靈芝菌種進行-20 ℃液體管冷凍保藏，可為靈芝菌種提供新的保藏方法，不僅能維持菌種活性，且成本低、方便操作，易推廣。

本研究通過Design Expert軟件采用Plackett-Burman和 Box-Behnken試驗設計，篩選適宜的靈芝母種-20 ℃低溫保護劑優(yōu)化配方，從而達到降低靈芝菌種維護成本，提高靈芝菌種質量的目的，也為栽培靈芝的生產(chǎn)者提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試菌株

靈芝菌種QL 02由貴州省土壤肥料研究所提供。

1.1.2試 劑

葡萄糖、瓊脂、二甲基亞砜、丙三醇、甲醇、蔗糖、聚乙二醇均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗設計

1.2.1菌絲活性測定

以菌落直徑法[7]為主要評價指標，將待測菌株接種在PDA平板培養(yǎng)基上于25 ℃環(huán)境中避光培養(yǎng)約6 d，將平板上已活化的菌絲用打孔器進行打孔，取圓形菌塊，放入不同編碼保護劑的凍存管中，-20 ℃低溫保藏3個月，取出凍存管中的菌塊，接種于PDA培養(yǎng)基中，25 ℃避光培養(yǎng)6 d，測量其菌絲平均生長速度[4]。

1.2.2篩選影響菌絲活性的關鍵因素

以-20 ℃凍存管菌種保護劑配方中的二甲基亞砜、丙三醇、甲醇、蔗糖、聚乙二醇含量為主要因素，進行Plackett-Burman篩選試驗，考察對-20 ℃保存后菌絲活性有顯著影響的因素。每個因素取最低(-1)和最高(1) 兩個水平，見表1。

表1 Plackett-Burman 試驗設計的因素水平表和編碼

1.2.3響應面優(yōu)化實驗設計

根據(jù)1.2.2關鍵因素篩選試驗結果，選取丙三醇、甲醇、蔗糖3個因素，進行三因素三水平的Box-Behnken試驗設計(見表2)，每個因素分別取低水平(-1)、中水平(0)和高水平(1)三個水平。對Box-Behnken 試驗設計結果建立數(shù)學回歸模型并分析。

表2 Box-Behnken試驗設計的因素水平表和編碼

1.2.4數(shù)據(jù)分析

本研究采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析；采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面結果分析。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗結果及分析

對表3中的數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得到菌絲生長速率為響應值的最優(yōu)方程為Y=2.53+0.48X1+0.13X2-0.38X3+0.79X4+0.38X5。且得到各因素效應評價，結果見表4。

表3 Plackett-Burman 試驗設計及響應值

根據(jù)效應值的大小可知，影響菌絲生長速度的關鍵因素依次為：X4(蔗糖)>X1(丙三醇)>X3(甲醇)>X5(聚乙二醇)>X2(二甲基亞砜)，見表4。其中X4(蔗糖)對菌絲生長速度 的影響達到極其顯著水平(p<0.01)，X1(丙三醇)和X3(甲醇)則達到顯著水平(p<0.05)，而X5(聚乙二醇)和X2(二甲基亞砜)影響不顯著。故選擇X4(蔗糖)、X1(丙三醇)和X3(甲醇)3個關鍵因素進一步做響應面優(yōu)化設計和分析。

表4 Plackett-Burman 試驗設計各因素效應

2.2 響應面試驗結果及分析

采用Design-Expert軟件對表5中的實驗數(shù)據(jù)進行分析，獲菌絲生長速度(Y)對蔗糖(A)、甲醇(B)和丙三醇(C)的二次多項回歸方程：

表5 Box-Behnken 試驗設計及結果

Y=5.18+0.44A+0.25B+0.32C-0.25AB+0.15AC+0.23BC-0.57A2-0.30B2-0.68C2

進一步對回歸模型進行方差分析，結果見表6。由表6可知，該回歸模型p<0.01(極顯著)，失擬項p>0.05(不顯著)，說明該模型可以用于-20 ℃保藏條件下提高菌絲活性配方的優(yōu)化。另外，模型的決定系數(shù)R2=0.932 6，說明擬合程度良好；校正決定系數(shù)R2Adj=0.845 9，故實際值與預測值相關性較高。表明該回歸模型可用于-20 ℃保藏條件下菌絲活性的分析和預測。經(jīng)方差分析可知，3個因素對菌絲活性影響的順序為：A>C>B，即蔗糖>丙三醇>甲醇，其中蔗糖作為保護劑含量對菌絲活性的影響極顯著(p<0.01)，丙三醇和甲醇對菌絲活性的影響顯著(p<0.05)；交互項AB，AC，BC均不顯著；A、B、C的顯著性水平與Plackett-Burman試驗結果一致。

表6 回歸模型方差分析結果

優(yōu)化后的最優(yōu)配方為：蔗糖5.8%、甲醇8%、丙三醇4.7%。菌絲生長速度理論值為5.25 mm·d-1。

2.3 優(yōu)化條件下菌絲生長速率驗證

對響應面法所得最優(yōu)配方的可靠性進行驗證，按照蔗糖5.8%、甲醇8%、丙三醇4.7%的配方配置保護劑溶液，進行3次平行試驗，-20 ℃保存3個月后最終測得菌絲生長速度為5.13 mm·d-1。

3 結 論

通過關鍵因素篩選試驗，篩選獲得保護劑中蔗糖含量、丙三醇含量、甲醇含量這3個影響-20 ℃低溫保藏靈芝菌株QL 02菌絲活性的關鍵因素。再通過響應面優(yōu)化試驗設計得到參數(shù)為蔗糖5.8%、甲醇8%、丙三醇4.7%的最優(yōu)保護劑溶液配方，菌絲生長速度理論值為5.25 mm·d-1。經(jīng)過實驗驗證后，在此最優(yōu)條件下，QL 02菌絲生長速率為5.13 mm·d-1，與所得模型預測值(5.25 mm·d-1)較為一致，表明該回歸模型合理可靠，具有一定的實用價值，為靈芝的-20 ℃低溫保藏保護劑配方優(yōu)化提供參考。