朱永明，王倩，郗艷菊★，郭永紅，吳國江

（1.河北維爾利動(dòng)物藥業(yè)集團(tuán)有限公司 050227；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 071001；3.河北省功能性飼料添加劑技術(shù)創(chuàng)新中心 050200；4.石家莊市獸用功能性添加劑工程技術(shù)中心 050200）

隨著養(yǎng)殖端減抗、限抗政策的推行，微生態(tài)制劑、中藥等行業(yè)開始占據(jù)主導(dǎo)地位，其中益生菌作為動(dòng)物保健品，具有調(diào)理腸道，維持腸道微生態(tài)平衡，促進(jìn)生長等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是最具有潛力的減抗、限抗的主力軍之一。

腸道微生物種類繁多，構(gòu)成了多樣性的微環(huán)境，其中存在400～500多種微生物與宿主共生，至少有1000多個(gè)菌落形成單位[1]。正常情況下，在一定的生理范圍內(nèi)，微生態(tài)區(qū)系隨著外界環(huán)境和飲食的改變而變動(dòng)，幼齡畜禽容易受到應(yīng)激影響，易導(dǎo)致微生態(tài)環(huán)境失調(diào)。調(diào)整并保障畜禽的消化道微生態(tài)平衡，是畜禽健康養(yǎng)殖的前提條件。

本研究從健康家禽腸道中，篩選對(duì)致病大腸桿菌具有顯著拮抗作用的且能產(chǎn)多種酶系的多功能芽孢桿菌作為目的菌株。芽孢桿菌可以消耗腸道內(nèi)的氧氣，造成厭氧環(huán)境，利于乳酸菌、雙歧桿菌等厭氧有益菌的增殖，從而調(diào)整腸道菌群的平衡，減少腸毒素的產(chǎn)生，促進(jìn)腸道的免疫和營養(yǎng)吸收功能，進(jìn)而達(dá)到降低家禽腹瀉率，提高家禽生產(chǎn)性能的和飼料報(bào)酬率的目的[2]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

致病性大腸桿菌（Eacterium coli ATCC 53832），由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院保存并提供。

從石家莊、保定、滄州等地養(yǎng)殖場(chǎng)采集健康家禽新鮮糞便，冷藏備用。

NB 培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基、NA 培養(yǎng)基的組成參考文獻(xiàn)[3]，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成參考尚偉(2012)[4]。

蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶鑒別培養(yǎng)基的配置參考文獻(xiàn)[5-7]

生理生化特性試驗(yàn)所用試液的配制參考文獻(xiàn)[8]。

1.2 儀器設(shè)備

MLS-3020高壓滅菌鍋，SANYO公司；SPX-250智能生化培養(yǎng)箱，寧波海曙賽征實(shí)驗(yàn)儀器廠；電子天平（Adventurer），OHAUS USA；電熱恒溫干燥箱，SANYO公司；超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司制造廠；BC/BD-325型低溫冰箱，海爾公司；123MB-1型光學(xué)顯微鏡，Nikon；ZHWY-211B雙層搖床，上海智誠分析儀器有限公司；TGL-16M高速冷凍離心機(jī)，湖南賽特湘儀器公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 益生菌菌株的分離

取新鮮家禽糞便1 g溶于10 mL無菌水中，振搖使其充分混合，85 ℃水浴20 min，然后用無菌水10倍梯度稀釋，取3個(gè)適當(dāng)稀釋梯度（10-2～10-6）的懸液在平板上涂布，每個(gè)稀釋度涂布3個(gè)平板，37 ℃培養(yǎng)24 h獲得單菌落。挑取形態(tài)不同的菌落分別在NA瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種做純培養(yǎng)，做好標(biāo)記。

2.2 病原菌平板的制備

取1支裝有5.0 mL無菌水的試管，將無菌水倒入活化好的病原菌（大腸桿菌）斜面試管內(nèi)，用滅菌竹簽輕輕將病原菌刮下，形成的菌懸液再倒入盛無菌水的試管中，用漩渦振蕩器振蕩1 min后，分別倒入盛有100 mL、約50℃的NA培養(yǎng)基的三角瓶中。混勻后分別立刻倒入雙碟平板（直徑9 cm），每個(gè)平板倒入約15 mL，冷卻后標(biāo)記病原菌平板種類，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 芽孢桿菌的初篩和復(fù)篩

挑取不同形態(tài)的單菌落分別轉(zhuǎn)接到病原菌平板上與病原菌進(jìn)行生長對(duì)峙試驗(yàn)，測(cè)量菌落直徑和抑菌圈直徑，并以后者與前者之比計(jì)算圈徑比，將產(chǎn)生較大抑菌圈的菌株保存于NA斜面，得到復(fù)篩菌株。

將復(fù)篩菌株分別接種于裝瓶量50 mL/250 mL的NB培養(yǎng)基中，37℃，180 r·min-1培養(yǎng)12 h作為種子液。將種子液按2%接種量接種于裝瓶量為50 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、180 r·min-1培養(yǎng)24 h，即得發(fā)酵液。將發(fā)酵液10000 r·min-1離心20 min，取上清液。以瓊脂打孔擴(kuò)散法測(cè)定各菌株發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌的抑菌活性。

制備牛奶平板、淀粉平板、纖維素平板，以瓊脂打孔擴(kuò)散法檢測(cè)各峰是否是蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶。若牛奶平板出現(xiàn)透明圈則證明含有蛋白酶；若用碘液加入到淀粉平板，出現(xiàn)透明圈則證明含有淀粉酶。若牛奶平板出現(xiàn)透明圈則證明含有蛋白酶。若用剛果紅染液滴加到纖維素平板，出現(xiàn)透明圈則證明含有纖維素酶。篩選抑菌圈和酶解圈較大且酶系較全的菌株保存?zhèn)溆米鳛樽罱K篩選菌株，進(jìn)行后續(xù)鑒定和檢測(cè)等相關(guān)工作。

2.4 芽孢桿菌菌株的種屬鑒定

2.4.1 菌落和菌體形態(tài)觀察

將篩得的菌株劃線接種于NA培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落的大小、表面、邊緣、透明度、隆起形狀等形態(tài)特征。以革蘭氏染色法觀察菌體形態(tài)和芽孢形態(tài)。

2.4.2 生理生化特性測(cè)定

生理生化特性試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[5]中相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行。

2.4.3 16S r DNA序列分析

參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行功能性菌株總DNA的提取，并進(jìn)行16S rDNA的擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物送至華大基因測(cè)序，將所測(cè)出的16S rDNA序列提交到GeneBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取相似性較高的模式菌株序列，利用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

3 試驗(yàn)結(jié)果及分析

3.1 功能性菌株的篩選結(jié)果

拮抗大腸桿菌的芽孢桿菌篩選結(jié)果見表1，經(jīng)NA培養(yǎng)基從雞糞中分離得到的86株菌株，經(jīng)大腸桿菌的拮抗試驗(yàn)，初篩得到10株圈徑比大于1.50的菌株，其中B-4M-6菌株圈徑比達(dá)到最大，為2.20。經(jīng)瓊脂打孔擴(kuò)散法檢測(cè)抑制大腸桿菌抑菌圈較大的菌株為B-4M-6和J-4M-26，抑菌圈面積分別可達(dá)237.6mm2和224.5mm2。因此篩選出B-4M-6和J-4M-26進(jìn)行酶解圈的試驗(yàn)驗(yàn)證。

表1 拮抗大腸桿菌篩選結(jié)果

B-4M-6和J-4M-26進(jìn)行酶解圈的試驗(yàn)結(jié)果見表2所示，B-4M-6菌株產(chǎn)淀粉酶、產(chǎn)纖維素酶和產(chǎn)蛋白酶能力明顯優(yōu)于J-4M-26菌株，因此最終選擇B-4M-6菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表2 篩選菌株酶解試驗(yàn)結(jié)果

將B-4M-6菌株進(jìn)行拮抗大腸桿菌和產(chǎn)酶效果的驗(yàn)證見圖1所示，B-4M-6菌株具有拮抗大腸桿菌和產(chǎn)淀粉酶、產(chǎn)蛋白酶和產(chǎn)纖維素酶的功能。

圖1 B-4M-6菌株功能性驗(yàn)證

3.2 功能性菌株的鑒定

3.2.1 B-4M-6菌株的菌落與菌體形態(tài)觀察

篩選出的功能性菌株B-4M-6的菌落、菌體和芽孢形態(tài)見圖2，菌落中等大小，圓形，邊緣不整齊不規(guī)則，白色不透明，表面干燥，呈高火山口狀；菌體呈桿狀，革蘭氏陽性菌，芽孢中生、端生，呈橢圓形及圓柱形。

圖2 B-4M-6菌株的菌落、菌體和芽孢形態(tài)

3.2.2 B-4M-6菌株的菌株的生理生化試驗(yàn)

根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)B-4M-6菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，結(jié)果見表3。根據(jù)菌株生理生化試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征可初步判斷B-4M-6菌株特征為芽孢桿菌屬菌株。

表3 B-4M-6菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果

3.2.3 B-4M-6菌株16SrDNA鑒定

提取B-4M-6菌株的16Sr DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示，電泳結(jié)果顯示各菌株序列長度均在1500bp左右。

圖3 B-4M-6菌株的16SrDNA的PCR產(chǎn)物電泳圖

將B-4M-6菌株16S rDNA的測(cè)得序列與相應(yīng)高同源性的標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rDNA構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（見圖4），并進(jìn)行相似性比較（見表4）。由結(jié)果可知，B-4M-6菌株與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）同源且相似性最高。故鑒定B-4M-6菌株為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）。

圖4 B-4M-6菌株的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

表4 B-4M-6菌株16S rDNA序列與高同源菌株的相似性比較

4 討論

解淀粉芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌有很高的親緣性[10]，可胞外產(chǎn)生蛋白酶[11]、脂肪酶[12]、纖維素酶[13]、淀粉酶[14]等多種消化酶。白海等[15]從綿羊糞便中篩選得到一株枯草芽孢桿菌，安全無毒害作用，具有促進(jìn)綿羊生產(chǎn)得特點(diǎn)。何深宏等[16]從牛糞中篩選得到一株高產(chǎn)纖維素酶的解淀粉芽孢桿菌，產(chǎn)纖維素酶活力可達(dá)31.9U/mL，可用于牛糞無害化降解。史媛媛等[17]從秸稈有機(jī)肥和土壤等自然環(huán)境中取樣，以模擬胃腸道環(huán)境對(duì)分離菌株進(jìn)行篩選，獲得了耐膽鹽、產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶的解淀粉芽孢桿菌B9。

芽孢桿菌具有抗逆性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，在逆境條件下能產(chǎn)生特殊性休眠體，當(dāng)環(huán)境條件恢復(fù)后，能快速的復(fù)蘇，增殖，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。據(jù)報(bào)道，芽孢桿菌能夠抑制致腹瀉病原菌的增殖，適合作為活菌制劑的微生態(tài)制劑菌種。某些芽孢桿菌能產(chǎn)抗菌肽，對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾桿菌、魏氏梭菌等引起幼齡動(dòng)物腹瀉的病原菌具有顯著的抑制作用[18]。目前，畜牧業(yè)主要應(yīng)用的有解淀粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等[19]。本研究從雞腸道中篩選得到1株可抑制致病性大腸桿菌且具有產(chǎn)酶能力的益生菌株B-4M-6，有望作為功能性微生態(tài)飼料添加劑應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)。

5 結(jié)論

從健康青年雞的糞便中篩選出一株拮抗大腸桿菌能力較強(qiáng)的菌株，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens），該功能性菌株具有產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶的能力，可用于改善動(dòng)物腸道健康。