汪 沙 段 華 沈 雪

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科微創(chuàng)中心，北京 100006)

子宮腺肌病是指具有生物活性的子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)侵入子宮肌層所致的局灶性或彌漫性病變[1]，是婦科常見的難治性疾病，主要表現(xiàn)為痛經(jīng)、月經(jīng)異常和不孕。子宮腺肌病的病因機(jī)制尚不明確，雖然基底內(nèi)膜腺體內(nèi)陷學(xué)說指出子宮內(nèi)膜基底層可能因妊娠或外力機(jī)械等因素受損，為子宮內(nèi)膜進(jìn)入肌層生長提供條件，但是在位內(nèi)膜侵入肌層并生長的方式目前還不甚清楚[2]。

內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)(endocannabinoid system，ECS)由一系列內(nèi)源性生物活性脂質(zhì)(也稱為內(nèi)源性大麻素)、特異性內(nèi)源性大麻素受體和負(fù)責(zé)內(nèi)源性大麻素合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解的酶組成[3,4]。大麻素受體是存在于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的可與內(nèi)源性大麻素結(jié)合促其在體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用的一類特殊蛋白質(zhì)，現(xiàn)公認(rèn)的主要包括1型大麻素受體(cannabinoid receptor 1，CB1)和2型大麻素受體(cannabinoid receptor 2，CB2)兩種類型，均屬于非特異性G蛋白耦聯(lián)受體家族[4]。

已有研究報(bào)道ECS參與子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞增殖凋亡的調(diào)節(jié)、細(xì)胞侵襲和遷移、免疫炎性狀態(tài)、病灶神經(jīng)支配和疼痛的感知等[5,6]。此外，還被證實(shí)可影響多種腫瘤的血管生成過程和纖維化疾病的纖維化進(jìn)程[7,8]。然而，關(guān)于ECS在子宮腺肌病發(fā)生發(fā)展中的作用鮮有報(bào)道。為此，本研究初步通過檢測ECS的主要成分CB1和CB2受體在子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜中的表達(dá)情況，并與正常子宮內(nèi)膜組織中大麻素受體的表達(dá)水平進(jìn)行對(duì)比，以探討大麻素受體對(duì)腺肌病發(fā)生的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2016-KY-012-01)，患者信息采集及標(biāo)本收集均于術(shù)前獲得患者充分知情同意并簽署知情同意書。

選擇2017年7月～2018年12月45例因彌漫型子宮腺肌病于我院婦科微創(chuàng)中心行全子宮切除術(shù)的子宮內(nèi)膜標(biāo)本為腺肌病組，組織病理診斷彌漫型子宮腺肌病，無子宮內(nèi)膜病變；同期34例因?qū)m頸疾病(宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級(jí)16例，宮頸癌ⅠA期18例)切除子宮的子宮內(nèi)膜標(biāo)本作為對(duì)照，組織病理診斷宮頸疾病，無子宮腺肌病，無子宮內(nèi)膜病變。2組均排除盆腔炎、生殖系統(tǒng)發(fā)育異常等疾病，排除合并內(nèi)分泌、免疫代謝性疾病，排除術(shù)前3個(gè)月內(nèi)曾使用性激素類藥物治療或?qū)m內(nèi)節(jié)育器。

子宮腺肌病組45例，對(duì)照組34例。2組年齡分別為(46.0±3.8)歲(37～53歲)和(44.2±5.0)歲(32～53歲)(t=1.820，P=0.078)。子宮腺肌病組中子宮內(nèi)膜處于增殖期23例，分泌期22例，對(duì)照組增殖期22例，分泌期12例(χ2=1.460，P=0.227)。2組子宮體積分別為(255.5±205.3)mm3和(83.9±44.2)mm3(t=7.922，P=0.000)。

1.2 方法

1.2.1 組織取材 2組子宮切除后立即由專人進(jìn)行組織取材，于無菌條件下自子宮前壁“Y”形剖開，兩側(cè)直達(dá)宮角，留取宮腔在位內(nèi)膜1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm，用生理鹽水沖洗去掉血液后分為兩份，一份置于10%中性福爾馬林溶液中24小時(shí)用于制備石蠟切片，另一份置入液氮中迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存用于提取RNA。

1.2.2 免疫組化二步法染色檢測CB1和CB2蛋白表達(dá) 組織標(biāo)本常規(guī)固定脫水、石蠟包埋，連續(xù)4 μm切片制片。切片于60 ℃烤片2 h，二甲苯及梯度乙醇常規(guī)脫蠟，乙二胺四乙酸(EDTA)高壓修復(fù)抗原，3%H2O2去離子水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，3%山羊血清封閉，輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加磷酸緩沖鹽溶液(PBS)按一定比例配好的一抗(CB1稀釋比例1∶300；CB2稀釋比例1∶100)，4 ℃孵育過夜。滴加即用型免疫組化試劑盒中的多聚酶結(jié)合物和放大劑，室溫孵育，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)避光顯色，鏡下觀察染色情況；蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。陰性對(duì)照以磷酸鹽緩沖液代替一抗進(jìn)行孵育。由2位觀察者對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行盲式閱片，蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色，DAB顯出的陽性表達(dá)為棕黃色。通過Image pro plus 6.0圖像分析軟件對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行分析，在400倍視野下檢測內(nèi)膜組織陽性染色部位的平均光密度值(mean optical density，MOD)進(jìn)行定量分析。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測CB1和CB2 mRNA表達(dá) 應(yīng)用RNA提取試劑盒(日本Takara公司)提取細(xì)胞總RNA，以10 μl體系反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增。CB1和CB2及內(nèi)參照磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因序列通過Gene Bank獲得。引物設(shè)計(jì)和合成由上海生工生物科技有限公司完成，引物序列見表1。qRT-PCR反應(yīng)采用7500 Real Time PCR儀(美國ABI公司)，擴(kuò)增反應(yīng)采用三復(fù)孔。PCR擴(kuò)增參數(shù)：95 ℃、10 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃、30 s，55 ℃、60 s，72 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)。生成定量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，計(jì)算機(jī)軟件分析循環(huán)閾值(Ct值)，通過2-ΔCt相對(duì)定量法[9]，計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，取3次平均值。

表1 qRT-PCR技術(shù)檢測CB1和CB2的引物序列

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜中CB1和CB2蛋白的分布

不論是腺肌病組還是對(duì)照組，CB1蛋白除了子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞外，還表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞，但在子宮內(nèi)膜腺上皮的表達(dá)強(qiáng)于間質(zhì)。分布主要在細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒(圖1)。與CB1蛋白類似，CB2蛋白亦廣泛表達(dá)于2組子宮內(nèi)膜組織中，以子宮內(nèi)膜腺上皮的表達(dá)為最強(qiáng)，主要分布在細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒(圖2)。

圖1 CB1蛋白的免疫組化染色：A、B分別為增殖期和分泌期的腺肌病組在位內(nèi)膜，C、D分別為增殖期和分泌期的對(duì)照組正常內(nèi)膜，棕黃色顆粒為陽性染色(×400，標(biāo)尺5 μm) 圖2CB2蛋白的免疫組化染色：A、B分別為增殖期和分泌期的腺肌病組在位內(nèi)膜，C、D分別為增殖期和分泌期的對(duì)照組正常內(nèi)膜，棕黃色顆粒為陽性染色(×400，標(biāo)尺5 μm)

2.2 2組CB1和CB2蛋白表達(dá)的比較

2組CB1、CB2蛋白表達(dá)的比較見表2。CB1蛋白在腺肌病組增殖期、分泌期在位內(nèi)膜中表達(dá)量(MOD值)均低于對(duì)照組；腺肌病組CB1蛋白在增殖期與分泌期的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而對(duì)照組增殖期低于分泌期。CB2蛋白在腺肌病組增殖期、分泌期在位內(nèi)膜中表達(dá)量均低于對(duì)照組；2組CB2蛋白的表達(dá)增殖期均低于分泌期。

表2 2組CB1蛋白、CB2蛋白表達(dá)量(MOD值)的比較

2.3 2組CB1和CB2 mRNA表達(dá)的比較

2組CB1、CB2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較見表3。CB1 mRNA在腺肌病組增殖期、分泌期在位內(nèi)膜中的表達(dá)量均低于對(duì)照組；腺肌病組CB1 mRNA在增殖期與分泌期的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在對(duì)照組中增殖期低于分泌期。CB2 mRNA在腺肌病組增殖期、分泌期在位內(nèi)膜中的表達(dá)量均低于對(duì)照組；2組CB2 mRNA的表達(dá)增殖期均低于分泌期。

表3 2組CB1、CB2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較

3 討論

3.1 CB1和CB2與腺肌病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系

目前有關(guān)ECS在子宮腺肌病中的研究有限。本研究結(jié)果顯示，與正常子宮內(nèi)膜相比，不論是增殖期還是分泌期，大麻素受體CB1和CB2在子宮腺肌病患者的在位內(nèi)膜中的表達(dá)均下降，提示ECS可能參與腺肌病的發(fā)生發(fā)展。Resuehr等[10]的研究也顯示CB1的表達(dá)在對(duì)照組的分泌期最高，不論在增殖期還是分泌期，CB1的表達(dá)在子宮內(nèi)膜異位癥的內(nèi)膜組織中最低。

有關(guān)ECS在生殖領(lǐng)域中的研究表明，ECS可能受性激素的影響[11,12]。Di Blasio等[13]通過文獻(xiàn)綜述了影響大麻素活性的脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)、N酰基磷脂酰乙醇胺-磷脂酶D(NAPE-PLD)以及大麻素受體CB1和CB2在女性生殖系統(tǒng)中的表達(dá)水平都隨著性激素而變化。這些報(bào)道與我們觀察到的正常內(nèi)膜中CB1和CB2的表達(dá)呈月經(jīng)周期性差異一致。ECS的這種周期性改變對(duì)正常生育功能的維持至關(guān)重要[14]。

3.2 CB1和CB2參與腺肌病發(fā)生發(fā)展的過程和臨床意義

子宮腺肌病通常被認(rèn)為是一種雌激素依賴性疾病，主要病理特征為炎性、纖維化、神經(jīng)血管生成和子宮收縮異常[15]。多項(xiàng)研究證實(shí)大麻素受體在炎癥調(diào)節(jié)中起著重要作用[16,17]。Iuvone等[18]的研究顯示，大麻素受體存在于炎性子宮內(nèi)膜組織中，且CB2的選擇性活化與子宮內(nèi)膜炎癥中的一氧化氮釋放過程有關(guān)。ECS和免疫系統(tǒng)之間的相互作用可能會(huì)影響胚胎植入過程中有關(guān)生物進(jìn)程的調(diào)節(jié)[19,20]。ECS可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、趨化功能和增殖能力參與多種免疫細(xì)胞系的調(diào)節(jié)，而這些免疫細(xì)胞對(duì)于維持正常的妊娠非常重要[21]?；谏鲜鲎C據(jù)和我們觀察到的結(jié)果，我們推測在子宮腺肌病的子宮內(nèi)膜組織中CB1和CB2的表達(dá)降低可能與免疫炎性狀態(tài)改變及腺肌病相關(guān)性不孕有關(guān)。

此外，動(dòng)物研究已經(jīng)證實(shí)CB1和CB2的上調(diào)可以選擇性地抑制子宮肌層的自發(fā)性收縮，如果在人的子宮中存在類似的機(jī)制，那么子宮腺肌病患者中存在的異常子宮收縮亦可以通過激活這2種受體來緩解[22]。至于前面提到的子宮腺肌病的其他病理特征，亦有研究證實(shí)針對(duì)大麻素受體CB1或CB2的靶向治療，可以在多種纖維化疾病中發(fā)揮抗纖維化的作用[23]。大麻素受體也被證實(shí)參與腫瘤的血管生成和侵襲進(jìn)程[7]。此外，有研究顯示CB1受體在子宮內(nèi)膜異位癥的動(dòng)物模型中可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥神經(jīng)支配和異位病灶的生長[24]。

本研究中我們還觀察到大麻素受體CB1和CB2在子宮腺肌病的表達(dá)并不完全一致，CB2在腺肌病組和對(duì)照組都存在孕激素依賴性，表達(dá)量在分泌期高于增殖期，而CB1的表達(dá)在子宮腺肌病的內(nèi)膜組織中失去月經(jīng)周期性改變。這一點(diǎn)與Resuehr等[10]的報(bào)道一致，他們認(rèn)為內(nèi)膜CB1的表達(dá)呈孕激素依賴性，而在子宮內(nèi)膜異位癥病人中該月經(jīng)周期性差異被打斷。通過與CB2的對(duì)比，我們所觀察到的子宮腺肌病內(nèi)膜中CB1喪失了月經(jīng)周期性改變可能表明它在腺肌病的發(fā)病機(jī)制中比CB2發(fā)揮著更為重要的作用。本研究為進(jìn)一步明確子宮腺肌病的病理機(jī)制提供理論依據(jù)，同時(shí)也為延緩子宮腺肌病發(fā)生發(fā)展提供潛在治療靶點(diǎn)。

本研究也存在一些局限性：首先，這只是一項(xiàng)初步的觀察性研究，尚需更多功能性研究來驗(yàn)證CB1在子宮腺肌病發(fā)病機(jī)制中的作用；其次，樣本量的不足可能會(huì)掩蓋一些潛在的差異。因此，更大樣本量的功能性研究有助于進(jìn)一步闡明這一問題。