于洋，張艷

吉林大學(xué) 古生物學(xué)與地層學(xué)研究中心，長春 130026

0 引言

孢粉學(xué)(palynology)是研究蕨類植物孢子和裸子植物花粉及被子植物花粉的科學(xué)，作為地學(xué)和生物學(xué)的交叉學(xué)科發(fā)展迅速[1--2]。孢粉學(xué)的研究對象主要為現(xiàn)代孢粉和化石孢粉。所謂化石孢粉就是當孢子和花粉在孢子囊和花藥中成熟之后，經(jīng)過風、水或動物等動力飛離植物母體，大部分落在土壤中，經(jīng)過漫長的地質(zhì)年代土壤變成了巖石，而這些保存在巖石中的孢子和花粉即成為化石孢粉[3]。孢粉產(chǎn)量大、易被搬運、孢粉壁易于保存，因此地球表面孢粉非常豐富，在很多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。在地質(zhì)方面，孢粉可以確定地層時代與地層劃分和對比[4--5]；在地理方面，孢粉分析資料可再造古植被，恢復(fù)古地理、古氣候[6--7]；在油氣和煤炭形成的原始物質(zhì)及其勘探、開發(fā)中，孢粉學(xué)可提供重要的佐證[8--10]；在考古方面，應(yīng)用孢粉分析可以了解古代人類生活環(huán)境[11--12]等。埋藏在巖石中的孢粉，不經(jīng)過一定的化學(xué)處理把其從巖石中分離出來是不宜在顯微鏡下觀察和研究的。另外孢粉個體很小，表面上的紋飾細微，光學(xué)顯微鏡分屬定種非常困難，而掃描電鏡具有放大倍數(shù)大、分辨率高和立體感強的優(yōu)點，已被廣泛用于孢粉學(xué)的研究[13]。但目前關(guān)于孢粉化石提取和掃描電鏡樣品制備的詳細方法的公開報道較少。筆者結(jié)合實驗室工作經(jīng)驗，報道了一般巖樣(泥質(zhì)巖、粉砂巖和灰?guī)r類)孢粉化石的提取和掃描電鏡觀察樣品的制備方法，以期為相關(guān)科研人員在工作中提供參考。

1 材料

掃描電鏡觀察的孢粉樣品取自吉林省輝南縣東南龍崗山脈中部的二龍灣瑪珥湖巖芯。二龍灣地區(qū)(42°18′N, 126°22′E)是新生代以來中國東北東部地區(qū)形成的龍崗火山群，氣候?qū)儆诘湫偷募撅L影響下的溫帶山地氣候，年平均降水量為500～800 mm，冬天最低溫度為-39 ℃，夏天最高溫度為37 ℃，植物區(qū)系屬“長白山植物區(qū)系”。在野外鉆取巖芯，巖芯長度2 400 cm，AMS14C年齡為0.5～32 ka B.P.[14]。

2 實驗方法

2.1 化學(xué)處理

孢粉化石的提取就是通過一定的化學(xué)處理把孢粉從巖石中分離出來。對不同的樣品，由于其沉積環(huán)境、介質(zhì)條件和巖石類型的不同，所用的化學(xué)試劑及其濃度、分析過程會有所不同，實驗中要根據(jù)巖石類型和有機質(zhì)含量選擇合適的處理方法。本文介紹一般巖樣(泥質(zhì)巖、粉砂巖和灰?guī)r類)孢粉的提取流程(圖1)。

圖1 孢粉化石提取流程Fig.1 Sporopollen fossil extraction process

(1)初步處理

① 清潔

對于較硬的樣品，可用水反復(fù)沖刷直到附著的污染物完全除去，而后烘干。對于較松軟的樣品可用小刀刮去表層污染物，而后烘干。對于灰?guī)r和白云巖之類的樣品，可用3%～5%的稀鹽酸浸洗，剝?nèi)ケ韺?，再用水沖干凈烘干待用。

② 取樣

孢粉分析取樣量決定于巖性。富含有機質(zhì)的碳質(zhì)頁巖、黑色泥巖取30～50 g；泥質(zhì)粉砂巖、粉砂巖和砂巖取100～150 g；純灰?guī)r、灰?guī)r和石膏等取100～300 g；砂礫巖、含鹽巖樣，取500～1 500 g，用清水淘洗和用熱水泡出這類巖樣中的泥砂部分作為分析材料用。

③ 碎樣

泥質(zhì)巖，粉砂巖類的樣品，碎樣過孔徑0.5 mm的篩子；灰?guī)r因為與酸作用十分劇烈，很容易溶解，碎到1～2 cm即可。

(2)化學(xué)處理

① 加稀鹽酸(HCl)

將已過篩稱重的樣品裝入1 000 mL的玻璃燒杯中，加入濃度為18%的稀鹽酸溶液，加鹽酸的量約為樣品體積的一倍左右，用玻璃棒充分攪拌，然后放置2 h，讓其充分反應(yīng)，直到起泡現(xiàn)象完全停止。鹽酸除能溶解碳酸鹽以外，鐵和鋁的不同狀態(tài)的大量三、二價氧化物也能被溶解。

② 加水洗滌

反復(fù)洗滌3～4次，注意保留水面上的懸浮物質(zhì)，直到pH=7。

③ 加氫氟酸(HF)

將樣品轉(zhuǎn)入1 000 mL的塑料燒杯中，慢慢地加入濃度為40%的氫氟酸，其量應(yīng)該滲浸整個樣品，并經(jīng)常攪動樣品讓其充分作用，放置48 h。

④ 加水洗滌

重復(fù)步驟(2)，洗滌到pH=7。

⑤ 加濃鹽酸

將樣品轉(zhuǎn)入1 000 mL的玻璃燒杯中，加入濃度為36%的濃鹽酸溶液約100 mL，放在電爐上煮沸15 min±，除去氟化物，見到黏稠狀混濁液變清或呈淡黃到黃綠色溶液止。

⑥ 加水洗滌

重復(fù)步驟(2)，洗滌到pH=7。

⑦ 重液浮選

將樣品洗到中性后，吸去樣品上部的水溶液，倒入50 mL容量的離心管中，用2 000 r/min的離心速度離心10 min，將水倒掉，加入2.25～2.2比重的重液(用碘化鎘、碘化鉀和蒸餾水配置)，加入量為樣品體積的2～3倍。樣品和重液一定要充分攪拌均勻，離心15 min(2 000 r/min)，分成兩層，下部是巖礦顆粒，上部浮著的是孢粉和其他有機物。把上部重液部分慢慢倒入或用小吸管吸入原來的燒杯中，再用比重為2.15～2.1的重液進行第二次浮選。往往第二次浮選出來的孢粉比第一次要多，所以浮選最好進行第二次。將含有孢粉的重液加2倍水稀釋，離心10 min(2 000 r/min)。將上部不含孢粉的重液倒入蒸發(fā)皿中回收，底部含孢粉的樣品收集在小瓶中加水保存。

2.2 掃描電鏡樣品制備

為了得到理想的標本，可先將收集的含孢粉液體取一滴滴在薄片上，制成活動片，在水份沒有蒸發(fā)之前立即在光學(xué)顯微鏡下觀察，找到所需的孢粉后用挑針挑取孢粉，小心轉(zhuǎn)移到黏有碳導(dǎo)電膠的電鏡座上。或者用7 μm 孔徑的篩布濾去水份，用黏有導(dǎo)電膠的電鏡座黏取篩布上收集的孢粉。第二種方法收集的孢粉量更大，但是會有雜質(zhì)。由于孢粉樣品本身含水量少，孢粉壁不易變形，采用自然風干的干燥方法即可[15]。干燥后，用洗耳球吹拂保證黏牢，在離子濺射儀中噴鍍鉑金膜(20 mA, 105 s)，而后裝入掃描電鏡進行觀察。

3 結(jié)果與討論

二龍灣瑪珥湖巖芯中的孢粉化石很多，類型也比較多，有喬、灌木植物樺木屬、鵝耳櫪屬、胡桃屬、榆屬和櫟屬等；草本植物蒿屬、莎草科、藜科和禾本科等；蕨類植物石松屬、卷柏屬和鐵線蕨屬等[14]。本文對胡桃屬、鵝耳櫪屬、櫟屬和榆屬進行觀察描述。孢粉活動片照片在奧林巴斯光學(xué)顯微鏡下拍攝，掃描電鏡照片在日本電子JSM--6700F型場發(fā)射掃描電鏡下拍攝(圖2)。

a1, b1,c1-胡桃屬(Juglans L.)花粉; a2, b2, c2-鵝耳櫪屬(Carpinus L.)花粉; a3, b3,c3-櫟屬(Quercus L.)花粉; a4, b4, c4-榆屬(Ulmus L.)花粉。圖2 孢粉化石的光學(xué)顯微鏡照片(a1-a4)和掃描電鏡照片(b1-b4，c1-c4)Fig.2 Light microscope images (a1-a4) and SEM images(b1-b4，c1-c4)of sporopollen fossils

胡桃屬(JuglansL.)花粉呈扁球形(圖2-a1, b1)，極面觀為多邊形，赤道面觀為闊橢圓形。花粉粒比較大，具散孔，赤道面孔數(shù)為6個，一個極面有孔，另一個極面無孔。掃描電鏡照片(圖2-b1，c1)顯示外壁具顆粒狀雕紋。光學(xué)顯微鏡下表面光滑。

鵝耳櫪屬(CarpinusL.)花粉呈扁球形(圖2--a2, b2)，一般極軸小于赤道軸，赤道面觀為近圓形到闊橢圓形，極面觀為圓形。孔處外壁外層一般不加厚，個別情形稍加厚，或多或少升高，突出于輪廓線，內(nèi)層不加厚，往往在外層升高處中斷，有時內(nèi)、外層分界不清。掃描電鏡下，外壁表面具顆粒?？讛?shù)為3個(圖2--b2, c2)。光學(xué)顯微鏡下表面光滑。

櫟屬(QuercusL.)花粉多為近球形(圖2--a3, b3, c3)，極面觀為3裂圓形，具3孔溝(圖2--a3, b3顯示一側(cè)的兩孔溝，圖2--c3顯示另一側(cè)的孔溝)，輪廓線為顯著波浪形或者較平。掃描電鏡照片(圖2--b3, c3)顯示外壁具顆粒狀、小瘤狀雕紋。光學(xué)顯微鏡下表面粗糙。

榆屬(UlmusL.)花粉呈扁球形(圖2--a4, b4)，具5孔，孔較小，近圓形。掃描電鏡照片(圖2--b4, c4)顯示外壁具縐波狀(腦紋狀)雕紋，輪廓線呈波浪形，縐波狀雕紋上有分布較密的顆粒。光學(xué)顯微鏡下表面具腦紋狀紋飾。

用本實驗方法提取的孢粉化石數(shù)量多，形態(tài)真實，結(jié)構(gòu)完整。孢粉表面的雕紋大小、形態(tài)以及孔溝的差異明顯，可作為分屬定種的重要依據(jù)。光學(xué)顯微鏡下活動片和固定片中孢粉的紋飾立體感差，看到的多為紋飾在平面上的投影，有些表面紋飾看不到。而在掃描電鏡下，可以從不同視角觀察，具有很強的立體感，可以清楚地觀察到瘤、顆粒和條紋等紋飾的差別，孔、孔溝的細節(jié)形貌清晰可見，彌補了光學(xué)顯微鏡的不足，為分屬定種提供了有力依據(jù)。

4 結(jié)論

(1) 經(jīng)過一系列化學(xué)處理得到巖石中的孢粉化石，制成掃描電鏡樣品進行觀察。孢粉形態(tài)真實，結(jié)構(gòu)完整。

(2) 相比于孢粉化石活動片和固定片，掃描電鏡下能清晰地識別孢粉紋飾和孔溝細節(jié)，在分屬定種工作中具有明顯優(yōu)勢。