張 政， 常娜娜， 杜 菲， 地麗胡瑪·阿吉， 張 成,2， 馬正海*， 畢玉海,2

1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 新疆 烏魯木齊 830046 2.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所,中國(guó)科學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100101

1989年Bergh等[1]發(fā)現(xiàn),在湖泊中病毒粒子極為豐富，達(dá)2.5×108mL-1，該結(jié)果引起人們對(duì)海洋、湖泊、河流、水庫(kù)等各類水環(huán)境病毒多樣性研究的興趣. 人們利用病毒宏基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，淡水環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)病毒以噬菌體為主[2-4]，這與噬菌體的宿主菌廣泛分布于各類水環(huán)境中有關(guān). 據(jù)報(bào)道，不同水環(huán)境中病毒群落組成和優(yōu)勢(shì)病毒種類存在差異，其主要受水質(zhì)、水溫、污染程度等環(huán)境因素，以及人類工農(nóng)業(yè)活動(dòng)和野生動(dòng)物活動(dòng)等因素影響，故水環(huán)境中病毒群落組成和多樣性亦能反映水質(zhì)狀況，可作為水環(huán)境生態(tài)質(zhì)量的評(píng)價(jià)指標(biāo)[5-6].

天山北麓為冰雪消融及降雨匯集的山溪河流在天山北坡形成的淤積平原，具有獨(dú)特的山地-綠洲-荒漠生態(tài)系統(tǒng). 其中天山北麓中段位于準(zhǔn)噶爾盆地南緣，東起烏魯木齊市，西至烏蘇市，南起前山帶，北至沙漠邊緣，地形總體由南東向北西傾斜，冰雪消融和降水補(bǔ)給形成烏魯木齊河、瑪納斯河等河流，該區(qū)域是新疆維吾爾自治區(qū)工農(nóng)業(yè)最發(fā)達(dá)和人口最集中的地區(qū)[7-9]. 天山北麓是干旱區(qū)山地生態(tài)系統(tǒng)和荒漠生態(tài)系統(tǒng)的交界地帶，對(duì)自然環(huán)境敏感，其中水庫(kù)等濕地尤為明顯，穩(wěn)定性和抗干擾性極差[10]，生物多樣性受自然條件和人類活動(dòng)雙重影響而變的極為復(fù)雜. 該研究選取天山北麓中段位于烏魯木齊市城區(qū)內(nèi)的三屯碑水庫(kù)(STW)、五家渠市附近的八一水庫(kù)(BYW)以及石河子市附近的蘑菇湖水庫(kù)(MGW)作為典型樣點(diǎn)，以病毒宏基因組學(xué)方法分析水庫(kù)病毒群落的組成特征及其功能，以及其中潛在的致病性病毒，以期為該區(qū)域水庫(kù)濕地的生態(tài)保護(hù)和合理化利用提供理論指導(dǎo)和參考依據(jù).

1 研究方法

1.1 典型樣點(diǎn)概述

STW(43°75′N、87°61′E)位于烏魯木齊市南端的綜合性游樂園水上樂園內(nèi)，緊鄰南郊客運(yùn)站、地鐵站和公交發(fā)車場(chǎng)等大型車流和人流聚集點(diǎn)，最大庫(kù)容1.8×106m3，其水源由附近的烏拉泊水庫(kù)及紅雁池水庫(kù)供給.

BYW(44°17′N、87°53′E)屬于烏魯木齊河流域，南側(cè)及西側(cè)緊靠烏魯木齊市米東區(qū)羊毛工鎮(zhèn)，東側(cè)為甘莫公路，北靠新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)102團(tuán)團(tuán)部，距五家渠市24 km，主要承擔(dān)農(nóng)業(yè)灌溉任務(wù)，正常蓄水位為462 m，庫(kù)容3.0×107m3[11].

MGW(44°29′N、85°57′E)位于石河子市區(qū)西北18 km處，是瑪納斯河流域庫(kù)容最大的水庫(kù)，承擔(dān)灌溉、養(yǎng)殖、調(diào)洪蓄水和納污等功能，水庫(kù)正常蓄水位為392 m，庫(kù)容1.8×108m3[9].

1.2 試驗(yàn)材料和試劑

1.6 μm玻璃微纖維過濾膜購(gòu)自英國(guó)Whatman公司；0.22 μm聚醚砜膜和0.8 μm聚碳酸酯膜均購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；DNase、RNaseⅠ、RNase H、Klenow exo-酶均購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾有限公司；PrimeScriptTMcDNA第一鏈合成酶、PrimeSTAR PCR kit和MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0均購(gòu)自大連寶生物公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit購(gòu)于德國(guó)凱杰公司. 引物FR26RV-N (5′-GC CGGAGCTCTGCAGATATCNNNNNN-3′)和FR20RV(5′-GCCGGAGCTCTGCAGATATC-3′)由上海生工生物工程有限公司合成. 其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.3 水樣采集

于2018年10月秋季枯水期末期采集STW、BYW和MGW表層水樣，每個(gè)水庫(kù)根據(jù)水域結(jié)構(gòu)選6個(gè)采樣點(diǎn)，采樣點(diǎn)間隔500 m以上，每點(diǎn)采樣850 mL，之后混合為 5 000 mL水樣. 樣品于-20 ℃便攜式冰箱保存，當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，存于-80 ℃冰箱備用.

1.4 病毒顆粒的富集

將Millipore快速過濾器與低壓真空泵收集瓶連接，水樣首先用1.6 μm Whatman GF/A玻璃微纖維膜過濾收集濾液，之后更換孔徑為0.22 μm的聚醚砜濾膜再次過濾，收集濾液并向其中加入FeCl3充分混勻(鐵離子終濃度達(dá)0.1 mg/L)，室溫黑暗條件下處理1 h，使病毒顆粒與Fe(OH)3形成絮凝物；隨后用0.8 μm聚碳酸酯濾膜過濾，取出濾膜并剪成細(xì)條置于50 mL離心管中，加入5 mL病毒重懸緩沖液(1 mL MgCl2、1 mL EDTA、2 mL L-抗壞血酸，pH為6.5)，于4 ℃黑暗條件下過夜；棄去濾膜，向病毒懸浮液中加入終濃度為17.5 g/L的NaCl以及8%的PEG 8 000，充分混勻后于4 ℃過夜；12 000g離心40 min，棄上清液獲得病毒沉淀.

1.5 病毒核酸提取

病毒沉淀重懸于500 μL PBS，將重懸液均分4份置于1.5 mL離心管，每管加入7 μL Turbo DNA酶、2 μL RNA酶Ⅰ和15 μL 10×DNase reaction buffer，37 ℃水浴60 min；加入6 μL 0.5 mol/L EDTA，65 ℃水浴10 min，終止消化. 病毒核酸提取按QIAamp Viral RNA Mini Kit說明書進(jìn)行，但在加入AVE病毒裂解液時(shí)不添加carrier RNA，以實(shí)現(xiàn)病毒DNA和RNA的同步提取[12].

1.6 病毒基因擴(kuò)增

以上述病毒核酸為模板，F(xiàn)R26RV-N為引物，利用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一鏈. 之后利用Klenow exo-酶合成ds cDNA，以病毒ds cDNA為模板，以FR26RV-N和FR20RV為引物進(jìn)行PCR. 擴(kuò)增參數(shù)：94 ℃，3 min； 94 ℃，30 s， 50 ℃，1 min， 72 ℃，1 min， 35個(gè)循環(huán); 72 ℃，5 min. 用MiniBEST DNA Fragment Purification Kit純化PCR產(chǎn)物，擴(kuò)增的病毒基因產(chǎn)物在深圳市惠通生物科技有限公司測(cè)序.

1.7 病毒宏基因組學(xué)分析

經(jīng)質(zhì)控獲得的病毒序列使用bbmap與NCBI nt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，除去宿主序列；使用Kraken基于序列不同k-mer長(zhǎng)度的方法將序列片段與病毒數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)映射，剔除占比小于總病毒序列1%的序列，并對(duì)每個(gè)樣本中的序列進(jìn)行病毒分類注釋；同時(shí)，用序列拼接軟件SPAdes和MEGAHIT將序列組裝成重疊群；使用BlastX對(duì)重疊群與Swiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)得到的序列進(jìn)行功能注釋.

1.8 柯薩奇病毒A10 (Coxsackievirus A10，CV-A10) VP1基因序列分析

基于高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，使用SPAdes和MEGAHIT軟件對(duì)3個(gè)水庫(kù)潛在的致病性病毒做進(jìn)一步分析，并對(duì)MGW樣本中注釋為腸道病毒A (EnterovirusA)的多個(gè)序列進(jìn)行組裝和拼接，將獲得的CV-A10序列與BLATn序列進(jìn)行比對(duì)，篩選并下載一致性較高和近年流行的CV-A10代表性序列. 使用ClustalW將獲得的CV-A10VP1基因序列與下載的參考株序列進(jìn)行比對(duì)，再通過MEGA 7.0軟件采用Tamura 3-parameter model參數(shù)、bootstrap1000構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹.

1.9 CV-A10 VP1抗原表位分析

使用DNAstar軟件預(yù)測(cè)CV-A10VP1的抗原表位，以Chou-Fasman和Garnier-Robson兩種方法預(yù)測(cè)其β-轉(zhuǎn)角、β-折疊和α-螺旋等二級(jí)結(jié)構(gòu)，以Kyte-Doolittle方法預(yù)測(cè)其親水區(qū)，以Emini方法預(yù)測(cè)其表面可及性區(qū)域，以Karlus-Schuk方法預(yù)測(cè)其柔性區(qū)域，以Jamson-Wolf方法分析其抗原指數(shù)，根據(jù)文獻(xiàn)[13]報(bào)道的方法綜合分析VP1蛋白上述結(jié)構(gòu)和功能特性，并預(yù)測(cè)其抗原表位.

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒宏基因組測(cè)序結(jié)果概述

質(zhì)控后，天山北麓中段典型水庫(kù)STW、BYW和MGW中分別獲得病毒序列 36 784 178、32 434 254 和 30 537 928 條，組裝形成重疊群分別為 15 400 個(gè)(總長(zhǎng)度為 14 764 455 bp，平均GC含量為47.03%)、11 894 個(gè)(總長(zhǎng)度為 8 394 134 bp，平均GC含量為48.10%)和 30 771 個(gè)(總長(zhǎng)度為 24 237 240 bp，平均GC含量為48.32%).

2.2 病毒群落組成與相對(duì)豐度分析

對(duì)各水庫(kù)水樣中病毒群落組成及相對(duì)豐度進(jìn)行分析，科分類階元結(jié)果(見圖1)表明，3個(gè)水庫(kù)病毒群落組成和優(yōu)勢(shì)病毒種類有一定共性，3個(gè)水庫(kù)中相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)病毒均屬于有尾噬菌體目(Caudovirales)，STW中長(zhǎng)尾噬菌體科(Siphoviridae)的相對(duì)豐度達(dá)89.7%，BYW和MGW中肌尾噬菌體科(Myoviridae)的相對(duì)豐度分別為88.1%和66.0%. 同時(shí)，3個(gè)水庫(kù)病毒組成也存在明顯差異，STW病毒多樣性較低，相對(duì)豐度較高的3個(gè)病毒科均屬于噬菌體；另2個(gè)水庫(kù)病毒種類相對(duì)豐富，除噬菌體占比較高外，還存在多種宿主病毒，如藻類DNA病毒科(Phycodnaviridae)、感染植物的帚狀病毒科(Virgaviridae,亦稱植物桿狀病毒科)、南方菜豆花葉病毒科(Solemoviridae)以及感染動(dòng)物的圓環(huán)病毒科(Circoviridae)和小RNA病毒科(Picornaviridae)，MGW中尚有7.4%的病毒在科水平無法注釋.

圖1 水庫(kù)病毒在科分類階元的相對(duì)豐度Fig.1 The viral relative abundance of the reservoirs at family level

3個(gè)水庫(kù)病毒在種分類階元的結(jié)果如圖2所示，MGW中相對(duì)豐度最高的病毒為歐文氏菌噬菌體ErwiniaphagevB_EamM-Y2和ErwiniaphageEa35-70，BYW中相對(duì)豐度最高的病毒為微囊藻噬菌體MicrocystisphageMaMV-DC和MicrocystisvirusMa-LMM01，STW中相對(duì)豐度最高的病毒為鏈霉菌噬菌體StreptomycesphageJay2Jay. 此外，3個(gè)水庫(kù)中的噬菌體還包括氣單胞菌屬噬菌體(Aeromonasphage)、微小噬菌體科的Gokushovirinae、泛生菌噬菌體(Pantoeaphage)、沙門氏菌病毒(Salmonellavirus)、亞硫酸桿菌噬菌體(Sulfitobacterphage)、聚球藻噬菌體(Synechococcusphage)、浮絲藻噬菌體(Planktothrixphage)和噬藍(lán)藻體(Cyanophage). 3個(gè)水庫(kù)中還存在多種宿主病毒，如感染植物的黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus)、辣椒輕斑駁病毒(Sowbanemosaicvirus)以及感染動(dòng)物的類圓環(huán)病毒(Circovirus-likegenomeDCCV-7)和腸病毒(EnterovirusA).

圖2 水庫(kù)病毒在種分類階元的相對(duì)豐度Fig.2 The viral relative abundance of the reservoirs at species level

2.3 病毒功能基因組成與相對(duì)豐度分析

由圖3可見，3個(gè)水庫(kù)病毒功能基因組成相似，主要包括病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因、病毒包裝相關(guān)基因和病毒復(fù)制相關(guān)酶的基因. 病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因包括病毒衣殼蛋白、尾蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白基因，其中衣殼蛋白基因相對(duì)豐度最高，在STW、MGW和BYW水庫(kù)中分別達(dá)3.8%、5.6%和7.2%；病毒包裝相關(guān)基因包括末端酶大亞基和內(nèi)部支架蛋白基因等，末端酶大亞基在病毒包裝中起主要作用，其基因在BYW、STW和MGW水庫(kù)中的相對(duì)豐度分別為2.1%、2.8%和4.0%；病毒復(fù)制相關(guān)酶基因包括DNA聚合酶、解旋酶、依賴DNA的RNA聚合酶、依賴RNA的RNA聚合酶、HNH核酸酶等基因，DNA聚合酶基因在STW、BYW和MGW水庫(kù)中的相對(duì)豐度分別為1.5%、3.2%和3.3%，解旋酶基因的相對(duì)豐度分別為1.6%、2.8%和3.3%.

圖3 病毒功能基因的相對(duì)豐度Fig.3 The relative abundance of the viral functional genes

2.4 CV-A10 VP1基因序列分析

共獲得CV-A10序列61條，得到一段注釋為CoxsackievirusA10VP1的序列(簡(jiǎn)稱“XJ201910”).VP1基因系統(tǒng)進(jìn)化(見圖4)顯示：除作為外群的腸病毒CV-A12外，CV-A10VP1基因形成了6個(gè)進(jìn)化分支，其中從MGW中獲得的XJ201910和原始病毒株Kowalik聚為Clade A；Clade B主要包含2008年后從俄羅斯、法國(guó)、西班牙等歐洲國(guó)家分離的病毒株；Clade C主要包含2008年前從俄羅斯、格魯吉亞、印度等歐亞國(guó)家分離的病毒株；Clade D主要為2010年前自我國(guó)山東省分離的病毒株；Clade E主要為2008年前自非洲分離的病毒株；Clade F包含2010年后自我國(guó)多個(gè)地區(qū)分離的病毒株.

圖4 CV-A10 VP1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of CV-A10 VP1 gene

2.5 CV-A10 VP1抗原表位分析

經(jīng)預(yù)測(cè)，VP1蛋白包含12個(gè)β-折疊區(qū)，11個(gè)β-轉(zhuǎn)角穿插其間；VP1蛋白還包含8個(gè)親水性區(qū)域、7個(gè)表面可及性區(qū)域、11個(gè)柔性區(qū)域和11個(gè)抗原指數(shù)較高的區(qū)域. 綜合分析以上潛在抗原表位的結(jié)構(gòu)和功能區(qū)，預(yù)測(cè)VP1蛋白包含7個(gè)抗原表位，表1展示了7個(gè)預(yù)測(cè)表位的位置、序列以及相應(yīng)區(qū)域的結(jié)構(gòu)和功能特征.

表1 CV-A10 VP1抗原表位預(yù)測(cè)

3 討論

病毒宏基因組學(xué)最早用于研究表層海水，其中獲得的病毒序列65%以上在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有相似的參考序列，這表明人們還缺乏對(duì)水環(huán)境中病毒群落的深入了解[14]. 目前，病毒宏基因組學(xué)在分析各類水環(huán)境病毒群落的多樣性和功能及其與宿主關(guān)系和環(huán)境因素相互作用等方面得到了廣泛應(yīng)用[15]，該研究使用病毒宏基因組學(xué)對(duì)天山北麓3個(gè)典型水庫(kù)進(jìn)行分析，以豐富天山北麓附近濕地的病毒學(xué)研究.

病毒顆粒的純化和富集是獲得足夠核酸開展病毒宏基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)，超速離心、絮凝、過濾和PEG沉淀等方法是富集病毒顆粒和棄除宿主核酸的主要方法[16-19]. 其中FeCl3絮凝已經(jīng)用于從海水、湖泊和庫(kù)塘水樣中富集病毒進(jìn)行宏基因組學(xué)研究[16]，與超速離心和超濾等方法相比，其所需水樣較少. 該研究將FeCl3絮凝和PEG沉淀方法聯(lián)用，成功地從5 L 淡水水樣中富集病毒用于病毒宏基因組學(xué)研究，建立了從環(huán)境水樣中富集病毒的簡(jiǎn)便高效的方法.

研究[4]顯示，淡水環(huán)境中的病毒群落多以噬菌體為主，其與噬菌體的宿主菌在環(huán)境中廣泛分布有關(guān). 筆者研究顯示，在科分類階元各水庫(kù)相對(duì)豐度最高的病毒均屬于有尾噬菌體目，變形菌、擬桿菌和黃桿菌是有尾噬菌體目的主要宿主，富含以上菌類的江水和富營(yíng)養(yǎng)淡水中有尾噬菌體的相對(duì)豐度較高[19-20]. 筆者所在課題組前期研究表明，變形菌、擬桿菌和黃桿菌為天山北麓水庫(kù)中的優(yōu)勢(shì)菌，可作為有尾噬菌體的宿主，從而促使有尾噬菌體的復(fù)制和豐度增加. 同時(shí)，不同水庫(kù)病毒群落的組成存在差異，BYW和MGW中肌尾噬菌體科的相對(duì)豐度較高，其為典型的烈性噬菌體，擁有廣泛的宿主范圍[21]，在溫帶地區(qū)富營(yíng)養(yǎng)淡水湖中的相對(duì)豐度在70%～80%之間[22]；STW中長(zhǎng)尾噬菌體科的相對(duì)豐度最高，其為溫和噬菌體，是土壤中的優(yōu)勢(shì)病毒種類[3]. 因淡水環(huán)境中噬菌體宿主組成隨水體營(yíng)養(yǎng)、深度、位置以及周邊環(huán)境和人為干擾等因素的影響而變化[23]，從而影響其中噬菌體的種類和豐度. STW于2018年進(jìn)行了淤泥清理工程，此工程可能促使淤泥中適于長(zhǎng)尾噬菌體增殖的宿主菌帶入水體并大量繁殖，進(jìn)而為長(zhǎng)尾噬菌體增殖提供了大量宿主. STW和MGW中微小噬菌體的相對(duì)豐度在3%以上，研究[24]顯示其可通過周邊陸地進(jìn)入水體中.

在種分類階元上，BYW中相對(duì)豐度最高的微囊藻噬菌體MicrocystisphageMaMV-DC和MicrocystisvirusMa-LMM01屬于微小噬菌體科，這兩種噬菌體宿主范圍狹窄[25-26]，而多數(shù)微小噬菌體科成員的宿主范圍較廣[27]，基于這兩種病毒的宿主專一性，可以推斷水庫(kù)中存在其宿主銅綠微囊藻和裂解微囊藻，而包括銅綠微囊藻在內(nèi)的一些微囊藻可產(chǎn)生微囊藻毒素威脅人類健康[28]. STW中相對(duì)豐度最高的病毒為鏈霉菌噬菌體StreptomycesphageJay2Jay，該病毒前期自土壤鏈霉菌lividansJI1326中分離得到[29]，Willoughby[30]曾提出部分鏈霉菌噬菌體更易感染湖底淤泥中的鏈霉菌，筆者結(jié)果再次表明STW的清淤工程促使淤泥中的宿主菌及其噬菌體進(jìn)入水體并大量繁殖. 歐文氏菌噬菌體ErwiniaphagevB_EamM-Y2和ErwiniaphageEa35-70在MGW中相對(duì)豐度較高，這兩種噬菌體均分離自梨樹或蘋果樹下的土壤，其宿主為造成果樹火疫病的歐文氏菌[31-32]，表明歐文氏菌噬菌體豐度較高與庫(kù)區(qū)農(nóng)墾活動(dòng)相關(guān).

除上述豐富較高的噬菌體外，水庫(kù)水樣中還含有一定量的動(dòng)物和植物病毒，其中包括多種病原體. BYW中圓環(huán)病毒科相對(duì)豐度為2.3%，其包含多種動(dòng)物病原體[33]，在種水平檢測(cè)到Circovirus-likegenomeDCCV-7. 小RNA病毒科在MGW中的相對(duì)豐度為1.5%，該病毒科包括脊髓灰質(zhì)炎病毒、口蹄疫病毒等多種感染人和動(dòng)物的重要病原體，在種水平檢測(cè)到的EnterovirusA是人類手足口病(hand and mouth disease，HFMD)的病原體，前期已有報(bào)道該病毒存在于水環(huán)境中并具有潛在公共衛(wèi)生隱患[34]. 該研究從病毒宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)中挖掘到多個(gè)EnterovirusA基因序列，并獲得了CV-A10VP1全長(zhǎng)基因序列，CV-A10是引發(fā)HFMD的主要病原之一，其在不同地區(qū)的分離病毒株存在一定差異[35]. 分析表明，CV-A10VP1基因型與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)分離的病毒株差異較大(見圖4)，基于二級(jí)結(jié)構(gòu)和功能域特征的綜合分析預(yù)測(cè)CV-A10VP1蛋白包含7個(gè)抗原表位區(qū)，其中275～284和286～293位抗原表位與Zhu等[36]闡述的VP1蛋白在279～283和289位的B細(xì)胞抗原表位分布區(qū)域存在部分重疊，以上抗原表位可作為制備CV-A10疫苗以及診斷和治療抗體的候選抗原表位. 感染植物的帚狀病毒科在MGW中的相對(duì)豐度為8.1%，該病毒科包含煙草花葉病毒屬、真菌傳桿狀病毒屬等多種病毒[37]，在種水平檢測(cè)到感染植物的黃瓜綠斑駁花葉病毒、辣椒輕斑病毒和藜草花葉病毒，這些病毒均為植物的病原體. 其中，煙草花葉病毒屬的辣椒輕斑病毒前期已從MGW周邊種植的辣椒中分離獲得，其還存在于健康人糞便中[38-39]；另一植物病毒——南方菜豆花葉病毒在BYW中的相對(duì)豐度為1.1%，南方菜豆花葉病毒自然寄主為菜豆和豇豆，可導(dǎo)致花葉和斑駁等病害，在我國(guó)被列為檢疫對(duì)象. 研究[40-41]發(fā)現(xiàn)，一些環(huán)境水樣和污水樣品中存在腸病毒、心病毒(Cardiovirus)和Cosavirus等致病性病毒，筆者所在課題組前期在MGW野鳥糞便樣品中也分離到H1N1亞型禽流感病毒[42]. 該研究在水庫(kù)水樣中檢測(cè)到多種可感染動(dòng)物、植物以及人的致病性病毒，可能是庫(kù)區(qū)農(nóng)牧漁業(yè)和人類活動(dòng)以及遷徙候鳥等野生動(dòng)物活動(dòng)所致，其對(duì)農(nóng)牧業(yè)和公共衛(wèi)生也構(gòu)成了潛在的威脅.

天山北麓水庫(kù)病毒群落的功能基因分析表明，3個(gè)水庫(kù)中相對(duì)豐度最高的基因均為病毒衣殼蛋白基因，其次為尾蛋白和糖蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白基因，與富含有尾噬菌體的塔拉海洋病毒群落的功能蛋白基因組成一致[43]. 病毒包裝基因以及DNA聚合酶等多種病毒復(fù)制相關(guān)酶基因的相對(duì)豐度均較高，說明水庫(kù)病毒群落復(fù)制活躍. 研究[44]發(fā)現(xiàn)，HNH核酸酶促進(jìn)了噬菌體基因組的復(fù)制，在筆者研究中病毒功能基因分析發(fā)現(xiàn)存在HNH核酸酶相關(guān)基因，推測(cè)病毒可能處于復(fù)制活躍期. 綜上，3個(gè)水庫(kù)中富含病毒包裝和復(fù)制相關(guān)蛋白和酶的多種基因，表明水庫(kù)病毒群落復(fù)制活躍.

4 結(jié)論

a) 該研究建立了FeCl3絮凝聯(lián)合PEG沉淀從淡水中富集病毒的方法，利用病毒宏基因組學(xué)方法分析了天山北麓3個(gè)典型水庫(kù)病毒的多樣性及其功能.

b) 天山北麓3個(gè)典型水庫(kù)的病毒群落均以噬菌體為主. 在科分類階元上，BYW和MGW中肌尾噬菌體科的相對(duì)豐度最高，STW中長(zhǎng)尾噬菌體科的相對(duì)豐度最高. 在種分類階元上，STW、BYW和MGW中相對(duì)豐度最高的病毒分別為鏈霉菌噬菌體、微囊藻噬菌體和歐文氏菌噬菌體. 不同水庫(kù)病毒群落組成差異與周邊環(huán)境和人類活動(dòng)等因素相關(guān).

c) 水庫(kù)病毒功能基因分析表明，噬菌體主要衣殼蛋白和尾蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白基因以及與病毒復(fù)制和裝配相關(guān)蛋白編碼基因的相對(duì)豐度較高，說明病毒復(fù)制活躍.

d) 水庫(kù)中存在多種致病性病毒，包括感染植物的黃瓜綠斑駁花葉病毒和辣椒輕斑駁病毒，感染動(dòng)物的類圓環(huán)病毒，以及感染人的腸病毒等，其中MGW中腸病毒相對(duì)豐度較高，并從中獲得了HFMD的病原體CV-A10VP1全長(zhǎng)基因，其與原始株Kowalik序列一致，說明水庫(kù)中存在潛在致病性病毒.