綦遠才， 周 翠， 何欣芮， 汪 鵬， 魏 虹*

1.三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室, 重慶 400715 2.西南大學生命科學學院, 重慶 400715

隨著經(jīng)濟和工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，土壤重金屬污染日益嚴重[1]. 2014年《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》指出，我國土壤無機污染物主要有Cd、Hg、As、Cu等8種重金屬，而Cd污染點位超標率最高，達7.0%[2]. Cd是一種具有長期性、滯后性和形態(tài)多樣性等特點的有毒重金屬[3]，植物從環(huán)境中吸收的Cd在體內(nèi)富集會引起一系列的生理生化反應，通過影響植物光合作用及呼吸作用等，最終抑制植物正常生長[4-5]. Cd還能通過食物鏈的傳遞對人類健康帶來潛在風險[6]. 因此，尋找有效途徑減輕土壤Cd污染帶來的風險非常重要.

與物理和化學修復相比，植物修復技術具有成本低、無二次污染等特點，在土壤重金屬污染修復中被廣泛應用[7-8]. 隨著相關研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)土壤重金屬生物有效性偏低，加之大多數(shù)高富集植物生物量較低，在一定程度上影響了重金屬污染土壤的植物修復效果[9]. 因此，如何有效提升土壤重金屬活性，以及篩選高生物量富集植物成為重金屬污染土壤植物修復領域關注的焦點[10]. 低分子量有機酸(low molecular weight organic acids，LMWOAs)廣泛存在于植物組織和根際中，土壤溶液中的重金屬離子可與其形成螯合物或絡合物，提高土壤中重金屬的流動性，促進與土壤固相結合的重金屬的釋放，從而增強土壤中重金屬活性[11]. 面對重金屬脅迫，植物根系合成分泌的不同低分子量有機酸在根際有機螯合重金屬的能力存在差異，主要通過一系列解吸附作用與土壤重金屬離子形成不同形態(tài)的可溶性絡合物，從而影響植物對Cd脅迫的修復效果[12-15]. 研究[16-18]顯示，蓖麻、鹽膚木等重金屬富集植物根系分泌的草酸和酒石酸等低分子量有機酸可酸化根際土壤，但對Cu、Pb等重金屬的活化程度存在差異，導致植物修復效果不同. 由此可知，不同工程物種和不同有機酸組合對植物修復的作用存在差異. 因此，有必要進一步探討外源有機酸對土壤重金屬形態(tài)和工程植物的植物修復效應特征，這將有助于土壤重金屬的植物修復應用和實踐.

秋華柳(SalixvariegateFranch.)是楊柳科柳屬的多年生灌木，具有發(fā)達根系，生物量大，生長繁殖快，且對Cd污染有良好的積累和耐受能力，在Cd污染土壤的植物修復中具有一定的應用潛力[19-20]，但其吸收積累Cd的能力有待進一步提升. 前期研究[21]表明，在Cd脅迫生境中，秋華柳根系分泌以草酸和酒石酸為主的低分子量有機酸，增強了植株對Cd的耐性和吸收. 那么添加外源草酸和酒石酸能否影響土壤中Cd的形態(tài)，進而提高秋華柳對Cd的吸收積累能力,以及不同有機酸的影響是否存在差異？鑒于此，該研究設計了盆栽模擬試驗，通過添加草酸和酒石酸兩種外源有機酸，探究其對土壤中Cd形態(tài)的影響及植物對Cd的吸收和積累特征，以期為土壤重金屬污染植物修復技術應用提供一定參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年10月在重慶市北碚區(qū)嘉陵江河岸(29°41′2″N、106°26′56″E)采集一年生健壯秋華柳實生苗，移入西南大學生態(tài)園試驗基地，進行生長適應性培養(yǎng). 2019年4月，將在三峽庫區(qū)嘉陵江消落帶采集的土壤碾碎，過5 mm篩，加入10 mg/kg Cd (CdCl2·2.5H2O)混勻. 根據(jù)前期研究結果，10 mg/kg是Cd脅迫對秋華柳造成毒性效應的初始濃度[21]. 保持潮濕平衡1個 月后，將處理好的土壤裝入盆缽(高10 cm，下徑12 cm，上徑14 cm)中，每盆3.5 kg. 試驗土壤的基本理化性質(zhì)如表1所示.

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)

1.2 試驗設計

2019年5月，選擇健康及長勢一致的秋華柳實生苗栽植于盆缽土壤中，并置于試驗基地遮雨棚(棚頂透明，四面透風)下，進行常規(guī)管理. 20 d后進行外源有機酸(草酸和酒石酸)處理，在秋華柳植株根部周圍以滴管方式一次性均勻加入有機酸，對照組加入等量去離子水. 2種外源有機酸各設置2個處理濃度——5和10 mmol/kg. 試驗以每2株為一個處理組，每個處理3次重復，試驗設計采用完全隨機法，各處理組設置見表2. 試驗期間進行相同標準的常規(guī)田間管理，無施肥，土壤含水量維持在田間持水量的60%～80%. 試驗用的盆缽下方有排水孔，澆水過程中存在一定的土壤淋濾液下滲流失現(xiàn)象. 盆缽下方放置不透水塑料托盤，以防止對下方土壤的污染. 60 d 后收獲植物全株并采集土壤樣品，測定相關指標.

表2 試驗處理

1.3 秋華柳生物量的測定

秋華柳全株收獲后帶回實驗室，用自來水沖洗干凈后利用超純水潤洗1次，根部用20 mmol/L的EDTA-Na2溶液浸泡5 min，然后迅速用超純水沖洗干凈，所有清潔后的植物根、莖、葉分別放入烘箱，在80 ℃下烘干至恒質(zhì)量，各器官生物量通過電子天平稱量獲得.

1.4 秋華柳Cd含量測定

用球磨儀分別將烘干的根、莖和葉樣品研磨成粉末，并分別稱取0.05 g，加入HNO3(6 mL)-H2O2(2 mL)消解液后用微波消解儀(Speed Wave SW-4，德國)進行消解，用超純水定容至50 mL，用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES，Thermo Fisher iCAP6300，英國)測定其Cd含量.

1.5 土壤中Cd形態(tài)的提取及含量測定

土壤經(jīng)自然風干研磨過篩后進行5種Cd形態(tài)的提取及其含量測定.

參考Tessier研究方法進行土壤Cd形態(tài)提取[22-23]，采用連續(xù)分級提取土壤中5種Cd形態(tài)——可交換態(tài)(EXC)、碳酸鹽結合態(tài)(CAR)、鐵錳氧化物結合態(tài)(OX)、有機物結合態(tài)(OM)和殘渣態(tài)(RES). 土壤有效性Cd包括EXC和CAR，土壤非有效性Cd包括OX、OM和RES[24-25]. 各提取態(tài)Cd含量均采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES，Thermo Fisher iCAP 6300，英國)測定.

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析. 對不同處理條件下土壤各形態(tài)Cd含量的差異、秋華柳生物量和Cd積累量特征分別進行雙因素方差分析(two-way ANOVA)，有顯著差異的指標再進行Tukey多重比較. 其中，富集系數(shù)和轉(zhuǎn)移系數(shù)計算方法如下：

BCF1=M/S

(1)

BCF2=M1/S

(2)

TF1=M2/M3

(3)

TF2=M3/M1

(4)

式中：BCF1為地上部分富集系數(shù)；BCF2為地下部分富集系數(shù)；TF1為枝-葉轉(zhuǎn)移系數(shù)；TF2為根-枝轉(zhuǎn)移系數(shù)；M為地上部分平均Cd含量，mg/kg；M1為根平均Cd含量，mg/kg；M2為葉平均Cd含量，mg/kg；M3為莖平均Cd含量，mg/kg；S為土壤中Cd含量，mg/kg.

2 結果與分析

2.1 外源有機酸對土壤Cd形態(tài)的影響

不同處理下土壤重金屬Cd形態(tài)含量的變化特征如圖1所示. 由圖1可見，與Cd脅迫對照組相比，添加外源有機酸顯著降低了土壤總Cd含量(P<0.05)，這與添加有機酸改變了土壤酸堿環(huán)境有較大關系. 相比于Cd脅迫對照組，在土壤中分別添加5、10 mmol/kg草酸和5、10 mmol/kg酒石酸后，各處理土壤總Cd含量分別降低了14.0%、14.0%、25.0%、20.1%，可見，酒石酸對土壤總Cd含量的影響更為明顯. 各處理下土壤中Cd的主要存在形態(tài)均以可交換態(tài)、碳酸鹽結合態(tài)和殘渣態(tài)為主，添加外源有機酸對土壤中各形態(tài)Cd含量有顯著影響.

注：圖柱右側小寫字母表示不同處理組間土壤中同種形態(tài)Cd含量差異顯著(P<0.05). RES—殘渣態(tài)Cd；OM—有機物結合態(tài)Cd；OX—鐵錳氧化物結合態(tài)Cd；CAR—碳酸鹽結合態(tài)Cd；EXC—可交換態(tài)Cd.圖1 外源有機酸對土壤中各形態(tài)Cd含量的影響Fig.1 Effects of exogenous organic acids on Cd forms in soil

與Cd脅迫對照組相比，添加外源有機酸降低了土壤中鐵錳氧化物結合態(tài)、碳酸鹽結合態(tài)和殘渣態(tài)Cd含量(P<0.05)，顯著增加了有機物結合態(tài)Cd含量(P<0.05). 酒石酸處理對土壤Cd形態(tài)的影響高于草酸處理，且5 mmol/kg酒石酸處理顯著增加了土壤可交換態(tài)Cd含量，但顯著降低了殘渣態(tài)Cd含量(P<0.05).

土壤中有效性Cd含量的變化直接影響著富集植物對土壤重金屬的修復效果. 添加外源有機酸提升了土壤中生物有效性Cd占比，但顯著降低了非有效性Cd占比(P<0.05)(見表3). 結果顯示，添加外源酒石酸對土壤Cd活化的效果優(yōu)于草酸.

表3 不同處理下土壤有效性Cd和非有效性Cd的占比

2.2 外源有機酸對Cd脅迫下秋華柳生物量的影響

不同處理下秋華柳地上及地下部分生物量的變化如圖2所示. 在整個試驗期間，秋華柳生長正常，未表現(xiàn)出明顯的Cd生物毒性癥狀. 與CK相比，添加外源草酸有降低秋華柳生物量的趨勢，添加外源酒石酸有增加植株生物量的趨勢. 統(tǒng)計檢驗結果顯示，各處理組秋華柳地上生物量與CK沒有顯著差異(P>0.05)，添加5 mmol/kg草酸顯著降低了植株地下生物量(P<0.05).

注：不同小寫字母表示各處理間差異顯著(P<0.05). n=3. 圖2 外源有機酸對秋華柳生物量的影響Fig.2 Effects of exogenous organic acids on biomass of S. variegata

2.3 外源有機酸對秋華柳吸收和積累Cd的影響

由圖3可見，添加外源酒石酸對秋華柳各器官Cd含量的影響顯著高于其他處理. 與Cd脅迫對照組相比，添加5 mmol/kg酒石酸顯著增加了秋華柳各器官的Cd含量(P<0.05)，其中根、莖、葉、地上部分和全株Cd含量分別增加了84.4%、79.0%、79.6%、79.3%和81.2%. 添加外源草酸沒有明顯改變植株各器官的Cd含量，且隨著處理濃度的增加，秋華柳根、莖、葉、地上部分和全株Cd含量均呈下降趨勢. 該結果表明，添加5 mmol/kg酒石酸能有效促進植物對土壤中Cd的吸收.

由圖3可見，添加外源酒石酸明顯增加了秋華柳各器官Cd積累量，添加外源草酸則降低了秋華柳Cd積累量. 與Cd脅迫對照組相比，添加5 mmol/kg酒石酸下，秋華柳根、莖、葉、地上部分和全株Cd積累量顯著提升(P<0.05)，分別增加了75.9%、85.9%、68.7%、62.2%和78.4%，表明秋華柳對Cd污染土壤的修復能力得到了明顯增強.

注：不同小寫字母表示不同處理組間秋華柳Cd含量差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示不同處理組間秋華柳Cd積累量差異顯著(P<0.05). 圖3 外源有機酸對秋華柳各器官Cd含量及積累量的影響Fig.3 Effects of exogenous organic acids on the Cd contents and accumulation in organs of S. variegata

不同有機酸處理對秋華柳根、莖和葉Cd含量及其積累量的方差分析結果如表4所示. 由表4可見，有機酸種類對秋華柳根、莖、葉、地上部分及全株Cd含量都有極顯著影響(P<0.01)，有機酸濃度以及有機酸種類與濃度的交互作用對秋華柳根、莖、葉及全株Cd含量有顯著影響(P<0.05)或極顯著影響(P<0.01). 有機酸種類對秋華柳根、莖、葉、地上部分及全株Cd積累量有顯著影響(P<0.05)或極顯著影響(P<0.01)，有機酸濃度對秋華柳莖Cd積累量有顯著影響(P<0.05)，有機酸種類與濃度的交互作用對秋華柳根、莖及全株Cd積累量有顯著影響(P<0.05)或極顯著影響(P<0.01).

表4 秋華柳各器官Cd含量及其積累量的方差分析

2.4 外源有機酸對植物修復效應的影響

各處理下秋華柳對Cd的富集系數(shù)和轉(zhuǎn)移系數(shù)如表5所示. 結果顯示，與Cd脅迫對照組相比，添加外源有機酸整體提升了秋華柳的富集系數(shù)，但對根-枝與枝-葉轉(zhuǎn)移系數(shù)未產(chǎn)生明顯影響. 添加5 mmol/kg酒石酸顯著提升了秋華柳地上和地下部分的富集系數(shù)，分別提升了173.0%和178.8%. 與Cd脅迫對照組相比，添加外源草酸對秋華柳的富集系數(shù)和轉(zhuǎn)移系數(shù)無顯著影響.

表5 外源有機酸對秋華柳Cd積累的影響

3 討論

3.1 外源有機酸對土壤Cd形態(tài)的影響

植物對土壤重金屬的去除效率在很大程度上取決于土壤重金屬的生物有效性[26]. 研究結果顯示，與Cd脅迫對照組相比，外源有機酸處理組顯著降低了土壤總Cd含量，并提升了土壤重金屬生物有效性含量. 已有研究[27-28]發(fā)現(xiàn)，低分子量有機酸可使土壤酸化，酸性環(huán)境下重金屬可從相對穩(wěn)定狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐妆恢参镂盏挠行B(tài)，從而提升土壤中有效性重金屬含量和植物富集重金屬的效率，增強植物修復重金屬污染土壤的潛能. 不同分子結構的有機酸對重金屬形態(tài)的影響存在差異[29-30]. 該研究中，酒石酸處理對土壤Cd形態(tài)的影響顯著大于草酸處理，且酒石酸處理下土壤Cd有效性含量高于草酸處理，促進了與酒石酸絡合的重金屬被植物吸收、轉(zhuǎn)運及積累，這與Cui等[31-32]的研究結果相一致.

研究土壤重金屬賦存形態(tài)變化為分析重金屬生物有效性提供了重要信息[33]. 在外源有機酸作用下，土壤Cd形態(tài)的積極顯著變化促進其生物有效性形態(tài)含量增加，秋華柳對Cd的富集系數(shù)和轉(zhuǎn)移系數(shù)也呈增加趨勢，說明添加外源有機酸活化了土壤有效性Cd(如可交換態(tài)Cd等). 有效性Cd更易被秋華柳根部吸收，并在植物組織中轉(zhuǎn)移，提高了Cd在植物體內(nèi)的積累和根莖之間的移動性. 添加外源酒石酸對土壤Cd形態(tài)的影響顯著高于添加外源草酸的影響，表明不同有機酸對土壤重金屬活化程度不同，從而使植物修復潛力存在差異. 從分子結構看，酒石酸為2,3-二羥基丁二酸，草酸是最簡單的二元酸(見圖4). 酒石酸氧化性強于草酸，這可能是2種有機酸對土壤重金屬活化程度表現(xiàn)出差異的重要原因. 與草酸相比，酒石酸具有更多含氧基團，能與Cd2+結合，并釋放更多的H+，加速游離態(tài)Cd向可交換態(tài)和有機物結合態(tài)Cd轉(zhuǎn)化，同時也影響了土壤中可變電荷位點的正電荷，如鐵錳氧化物結合態(tài)Cd結合位點減少，從而降低了鐵錳氧化物結合態(tài)Cd含量，以及促進碳酸鹽結合態(tài)Cd向可交換態(tài)Cd轉(zhuǎn)化、殘渣態(tài)Cd向其他形態(tài)Cd轉(zhuǎn)化，使土壤中有效態(tài)Cd含量增加，增強了秋華柳根部吸收轉(zhuǎn)移Cd的能力[34-35]. 因此，秋華柳對Cd污染修復效果在一定程度上取決于土壤Cd的形態(tài)，而酒石酸對秋華柳積累和存儲Cd的過程中具有重要作用.

圖4 酒石酸和草酸分子結構Fig.4 Molecular structure of tartaric acid and oxalic acid

3.2 外源有機酸對秋華柳富集和積累Cd的影響

秋華柳對Cd具有較高的耐受性和較強的調(diào)節(jié)能力[36]. 研究結果顯示，10 mg/kg Cd脅迫沒有明顯影響秋華柳地上、地下生物量，植株生長良好，體現(xiàn)了秋華柳較高的Cd耐受能力. 有機酸雖能活化土壤中重金屬、降低重金屬毒性、促進植物吸收，但重金屬積累在植物體內(nèi)會抑制植株光合效率、破壞細胞壁、延緩植物生長[37].

低分子量有機酸是重金屬的有機配體，可通過參與土壤重金屬的吸收和積累等過程，促進土壤重金屬植物修復[38]. 但不同種類的低分子量有機酸對植物富集重金屬的影響存在差異[39]. 該研究結果表明，在添加外源酒石酸下，秋華柳對Cd的富集和積累量顯著高于添加外源草酸下秋華柳對Cd的富集和積累量. 添加外源酒石酸對秋華柳吸收和富集Cd具有顯著效果，酒石酸具有成對的羧基和羥基依附在碳原子上，能與重金屬形成穩(wěn)定的環(huán)狀結構；而草酸結構簡單，形成的重金屬螯合物不穩(wěn)定，活化重金屬潛力較弱[40]. 已有研究[41-42]表明，添加外源酒石酸能促進富集植物修復重金屬污染土壤的主要原因在于，添加酒石酸會增加外界環(huán)境中H+濃度和Eh，促進重金屬從土壤膠體解吸后轉(zhuǎn)入土壤溶液，使土壤有效性Cd含量增加，有利于秋華柳根部吸收活化Cd. 酒石酸還可通過促進秋華柳體內(nèi)酶和非酶抗氧化劑以及某些耐受基因表達來減輕Cd的毒性，以維持細胞正常形態(tài)，增強秋華柳對Cd污染土壤的修復能力[43]. 此外，添加外源有機酸促進了土壤中可交換態(tài)Cd含量的增加，使秋華柳根部對重金屬的富集量及根莖對重金屬的轉(zhuǎn)移系數(shù)增加，可促進植物地上部分對重金屬的生物萃取能力，有利于提高植物富集系數(shù)，降低遷移系數(shù)，使植物能在逆境環(huán)境中生存. 該研究發(fā)現(xiàn)，添加外源草酸雖然降低了土壤總Cd含量，但與Cd脅迫對照組相比，并未提升秋華柳Cd含量及積累量，這可能與草酸活化的Cd更易被土壤微生物富集等因素有關，從而導致秋華柳Cd積累量降低，但尚需后期做進一步深入研究.

除不同有機酸種類處理效果表現(xiàn)出差異外，添加外源酒石酸對土壤重金屬的修復效應還表現(xiàn)出高抑低促的濃度效應. 該研究中，添加5 mmol/kg酒石酸對土壤Cd形態(tài)及秋華柳Cd富集及積累量、富集系數(shù)和轉(zhuǎn)移系數(shù)均高于添加10 mmol/kg酒石酸處理. 已有研究[28]發(fā)現(xiàn)，在植物體內(nèi)酒石酸在酶作用下能轉(zhuǎn)化為琥珀酸，琥珀酸有助于Cd在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運，但Cd脅迫在一定程度尚會降低酶活性，使酒石酸在植物體內(nèi)堆積，過量酒石酸可能導致植物毒害，降低根系吸收土壤中的重金屬，從而降低植物對土壤重金屬的吸收. 因此，較低濃度的酒石酸在秋華柳修復Cd污染土壤中可發(fā)揮更重要的作用.

4 結論

a) 與外源草酸相比，添加外源酒石酸對土壤Cd形態(tài)的影響更顯著，其中添加5 mmol/kg酒石酸可顯著增加土壤可交換態(tài)Cd含量，降低土壤殘渣態(tài)Cd含量，增加土壤生物有效性Cd含量.

b) 與Cd脅迫對照組和草酸處理組相比，添加5 mmol/kg 酒石酸可顯著增加秋華柳各器官的Cd含量和積累量及富集系數(shù)，顯著增強秋華柳修復Cd污染土壤的能力.

c) 外源添加5 mmol/kg酒石酸可應用于秋華柳對Cd污染土壤的植物修復實踐.