蔣欣怡，王書卿，楊怡萱，朱振洪

（浙江中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310053）

塑料制品具有強(qiáng)度較高、質(zhì)量較輕、抗腐蝕、價(jià)格較便宜等優(yōu)點(diǎn)，在人們生產(chǎn)生活中得到了廣泛應(yīng)用[1]。塑料的應(yīng)用在給人們帶來極大便利的同時(shí)也帶來了很大程度上的負(fù)面影響。當(dāng)今，大部分廢棄塑料制品只有通過焚燒、使用化學(xué)試劑等方法才能快速降解，在自然環(huán)境中通過光、生物降解[2]的速度非常緩慢，大概需要幾百年的時(shí)間才可能降解到完全消失[3]，研究發(fā)現(xiàn)有一些菌種可以以塑料為食并在其上生長(zhǎng)，菌種產(chǎn)生的酶將其轉(zhuǎn)化為自己生長(zhǎng)所需的物質(zhì)[4-5]且不會(huì)破壞[6-7]環(huán)境[8]。所以當(dāng)前利用生物技術(shù)處理廢棄塑料[9]已經(jīng)成為了非常值得研究的內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

胰蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、可溶性淀粉、聚乙烯醇（PVA）、聚氯乙烯（PVC）。

1.1.2 主要儀器

PCR擴(kuò)增儀、臺(tái)式冷凍離心機(jī)、立式壓力蒸汽滅菌器、瓊脂糖DNA凝膠電泳儀。

1.2 方法

1.2.1 土壤菌種的采樣

在杭州市生活垃圾填埋場(chǎng)周邊的土壤中采樣，挖取地表下約15cm的土壤用塑料袋裝好，取回保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 土壤微生物的分離

（1）通過稀釋涂布的方法將菌種進(jìn)行濃度梯度分離，劃分成細(xì)菌、真菌。（2）觀察并標(biāo)記不同形態(tài)、類型的菌落，進(jìn)行挑菌分離培養(yǎng)。（3）通過分析菌種的長(zhǎng)勢(shì)、形態(tài)，觀察其中是否含有其他菌種，并再次進(jìn)行分離，以確保菌種分離的完整性。

1.2.3 菌種的選擇性培養(yǎng)

將固定培養(yǎng)基培養(yǎng)的純化菌種培養(yǎng)在以PVA、PVC為碳源的培養(yǎng)基上，觀察是否生長(zhǎng)（細(xì)菌大概1-2天的生長(zhǎng)周期，放線菌和真菌大概3-5天生長(zhǎng)周期）。

1.2.4 菌種的液體培養(yǎng)以及對(duì)塑料薄模和塑料包裝袋的分解速率及測(cè)定

（1）配制液體培養(yǎng)基（真菌為改良的馬丁氏培養(yǎng)基，放線菌為高氏1號(hào)培養(yǎng)基，細(xì)菌為L(zhǎng)B培養(yǎng)基）。（2）將紫外線處理后的塑料薄模長(zhǎng)寬約5cm×5cm的小塊片段放入液體培養(yǎng)基中，并將相關(guān)的菌種接種到其液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，大約2-3天后拿出液體培養(yǎng)基中的塑料薄模小塊片段，通過對(duì)照實(shí)驗(yàn)，觀察菌種對(duì)其的影響。（3）用100mL錐形瓶培養(yǎng)菌種，并將紫外線處理后的塑料薄模小塊片段放入液體培養(yǎng)基中，觀察分解效率和強(qiáng)度。（4）通過對(duì)照實(shí)驗(yàn)，改變碳源（氯化鈉1g，胰蛋白胨1g，酵母粉0.5g，蒸餾水100ml）的用量，促進(jìn)菌種基因的表達(dá)，減少遏制基因的作用，對(duì)比碳源的用量觀察分解速率找出最適合表達(dá)基因、酶活性的用量。（5）加入表面活性劑，改變培養(yǎng)液的用量，促進(jìn)酶的活性，促使微生物能夠發(fā)酵產(chǎn)生更多的酶，促進(jìn)對(duì)塑料的降解。

1.2.5 菌種的凍存與復(fù)蘇

菌種凍存一般加20%甘油，-80℃保存。復(fù)蘇時(shí)將甘油菌保存的菌種冰上解凍后，劃線接種在固體培養(yǎng)基上，再將固體培養(yǎng)基的單菌落接種到液體培養(yǎng)基中。

1.2.6 基因組的提取與檢測(cè)

（1）運(yùn)用試劑盒提取降解塑料的基因組，將提取的基因組溶解于30μL TE緩沖液中。（2）將0.5μL 10×Loadding Buffer與4.5μL DNA溶液混合，加入凝膠中，用凝膠成像儀觀察并拍照。

1.2.7 PCR擴(kuò)增與電泳檢測(cè)

（1）設(shè)置PCR程序和體系PCR引物：ddH2O 18.26μL；PCR Buffer 2.5μL；dNTP 2μL；上游引物：0.25μL；下游引物：0.25μL；模板（基因組）1μL。PCR程序：a.94℃預(yù)變性；b.94℃變性30S；c.57℃復(fù)性30S；d.72℃延伸30S，返回第2步，循環(huán)3次；e.94℃變性30S；f.54℃復(fù)性30S，72℃延伸30S，返回第5步，循環(huán)27次；g.72℃，10min。（2）將0.5μL10×Loadding Buffer與4.5μL PCR產(chǎn)物混合，加入凝膠中，用凝膠成像儀觀察條帶質(zhì)量。1.2.8測(cè)序（測(cè)定核苷酸序列）

將PCR產(chǎn)物和上下游引物ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）和ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）送到上海桑尼生物技術(shù)公司測(cè)序。

1.2.9 將序列網(wǎng)上比對(duì)鑒定菌種

通過NCBI序列比對(duì)查找同源性較高的片段并添加到MAGA5.0軟件中進(jìn)行比對(duì)運(yùn)算，并制作進(jìn)化樹并分析其同源性。

2 結(jié)果

2.1 通過稀釋涂布的方式進(jìn)行初步的種屬菌種分離

通過稀釋涂布法，將培養(yǎng)液稀釋到10-6所形成的濃度為真菌分離最適宜的挑菌濃度，將培養(yǎng)液稀釋到10-7所形成的濃度為細(xì)菌分離最適宜的挑菌濃度，并且培養(yǎng)的菌種形成肉眼可觀察到的單菌落。菌落大小、形態(tài)各異，放線菌顏色大部分較為鮮艷并且有光澤、略帶有土腥味，細(xì)菌顏色大部分偏黃色略帶臭味，真菌偏乳黃色，乳白色居多略帶酒香味和霉味。

2.2 接種在固定菌種的培養(yǎng)基中進(jìn)行再次分離

初步分離得到單菌落培養(yǎng)，細(xì)菌分離出4種不同形態(tài)、顏色和大小的菌株、真菌分離出3種不同形態(tài)、顏色和大小的菌株，并且菌落特征與初步分離得到的菌落特征基本一致。

2.3 將純化的菌種培養(yǎng)在以PVA（聚乙烯醇）為唯一碳源的培養(yǎng)基上

當(dāng)2.2中初步分離的菌株在含PVA的選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)真菌1、2、3號(hào)可在PVA選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并且長(zhǎng)勢(shì)良好，無雜菌污染，形成單菌落，菌落形態(tài)、顏色和大小也與固定培養(yǎng)基形態(tài)一致，如圖1（A）所示。而分離的細(xì)菌有兩株可在PVA選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，如圖1（B）所示。

圖1 微生物在PVA選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)

2.4 將純化的菌種培養(yǎng)在以PVC（聚氯乙烯）為唯一碳源的培養(yǎng)基上

由圖2可知，所分離的真菌1、2、3號(hào)也可在PVC選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并且長(zhǎng)勢(shì)良好，無雜菌污染，形成肉眼可觀察到的單菌落形態(tài)。所分離的細(xì)菌均不可在PVC選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。

圖2 真菌在PVC選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)

2.5 菌種的液體培養(yǎng)以及對(duì)塑料薄膜和塑料包裝袋的分解速率及測(cè)定

從圖3中可以看出，與對(duì)照組（長(zhǎng)5cm，寬5cm）相比，真菌1、2、3號(hào)具有一定的分解效果，真菌1號(hào)作用的塑料薄膜邊緣皺略縮成團(tuán)狀（長(zhǎng)4.5cm，寬4.5cm）并且中間有小孔，用手觸摸質(zhì)感不及對(duì)照組光滑；真菌2號(hào)作用的塑料薄膜（長(zhǎng)3cm，寬3cm）邊緣有部分皺縮用手觸摸質(zhì)感不及對(duì)照組光滑；真菌3號(hào)作用的塑料薄膜中間皺縮（長(zhǎng)5cm，寬2cm）用手觸摸質(zhì)感不及對(duì)照組光滑。

圖3 三株真菌對(duì)塑料薄膜作用效果圖

2.6 基因組的提取與PCR的擴(kuò)增

通過提取基因組作為模板，并利用PCR技術(shù)，以ITS1和ITS4作為上下游引物，擴(kuò)增獲得PCR產(chǎn)物。通過凝膠電泳成像儀拍照顯示，從真菌1、2、3號(hào)中擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物大小為400bp左右（如圖4所示）。產(chǎn)物送至上海桑尼生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序。

2.7 序列的分析

由圖5可知，真菌1號(hào)與白地霉WLL1株擁有最高的同源性，同屬于地霉屬，生物體間的遺傳差異數(shù)值大約為0.2個(gè)單位；真菌2號(hào)與白念珠菌培養(yǎng)CBS：11616和真菌CMH122擁有最高的同源性，同屬于地霉屬，生物體間的遺傳差異數(shù)值大約為0.5個(gè)單位；真菌3號(hào)與地霉分離株M14擁有最高的同源性，也同屬于地霉屬，生物體間的遺傳差異的數(shù)值大約為1個(gè)單位。

圖5 真菌1、2、3號(hào)進(jìn)化樹分析圖

3 討論

近年來，生物降解塑料得到重視。對(duì)于中國(guó)這樣一個(gè)塑料制品生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，生物降解塑料的研發(fā)、生產(chǎn)與應(yīng)用對(duì)塑料產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有更加重要的意義，也符合中國(guó)的國(guó)情、可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略。此實(shí)驗(yàn)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)綠色資源的循環(huán)利用。同時(shí)，生物降解的方法也逐漸受到人們的重視，對(duì)能源的再利用也有很深遠(yuǎn)的影響。根據(jù)這種現(xiàn)狀我們的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目尋找具有塑料分解能力的微生物[10]，并在實(shí)驗(yàn)后期嘗試找出其中分解能力較強(qiáng)的菌種，提取其關(guān)鍵酶[11]，高表達(dá)菌株篩選并進(jìn)行基因改造，大大提高了分解塑料的能力，運(yùn)用到后期生產(chǎn)的話，可為解決塑料污染問題提供方向。

目前，利用微生物降解塑料已經(jīng)成為了研究熱點(diǎn)。宋力等[12]研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境因素和微生物數(shù)量均會(huì)影響生物塑料在水生系統(tǒng)中的降解效果。環(huán)境因素主要是通過相應(yīng)微生物產(chǎn)生的生物塑料降解酶影響生物塑料的降解性;海水中附著的微生物數(shù)量則通過改變塑料的形狀影響生物塑料的降解性。2016年，可消化PET塑料的細(xì)菌Ideonella sakaiensis 201-F6品種被發(fā)現(xiàn)，相比其他的細(xì)菌酶，這種酶能更快更有效地對(duì)塑料進(jìn)行分解，具有用于生物循環(huán)的潛能[13]。與此同時(shí)，某團(tuán)隊(duì)研究出了一種混菌體系可以高效降解塑料。他們根據(jù)細(xì)菌一種十分巧妙的代謝方式，來保持混菌系統(tǒng)的穩(wěn)定，并且這些菌可以相互協(xié)作，更高效地完成對(duì)塑料的降解[14]。

本實(shí)驗(yàn)利用基因組提取技術(shù)、PCR技術(shù)對(duì)微生物進(jìn)行分子生物學(xué)基礎(chǔ)操作，通過擴(kuò)增片段完成測(cè)序及運(yùn)用MAGA生物軟件對(duì)序列的同源性進(jìn)行鑒定，推斷出其種屬以及同源性[15]。根據(jù)目前研究結(jié)果顯示能夠分解塑料的微生物分布特點(diǎn)以及作用強(qiáng)度、作用方式及微生物的類別，后續(xù)需繼續(xù)大量發(fā)酵提取蛋白并對(duì)其進(jìn)行純化，通過核磁共振儀、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、酵母雙雜交等技術(shù)分析蛋白的結(jié)構(gòu)和功能或者進(jìn)行微生物分解塑料功能片段的擴(kuò)增，以及過表達(dá)、基因敲除等方式對(duì)基因進(jìn)行功能分析，以便于更好地解決生活中的白色污染問題[16]，從而有利于促進(jìn)我們處理塑料制品采用便捷的方式。

4 結(jié)束語

本文運(yùn)用微生物分離、發(fā)酵、分子鑒定的技術(shù)，前期通過取土樣分離微生物，隨后在選擇培養(yǎng)基（PVA、PVC）上培養(yǎng)觀察生長(zhǎng)狀況，再運(yùn)用微生物液體培養(yǎng)基發(fā)酵技術(shù)以及觀測(cè)微生物對(duì)塑料薄模的分解能狀況，進(jìn)一步判斷微生物的分解能力，最后利用分子鑒定技術(shù)對(duì)所分離的微生物進(jìn)行種屬鑒定。下一步可通過微生物培養(yǎng)條件的優(yōu)化，以及相關(guān)酶基因的研究，更好地發(fā)揮微生物對(duì)廢棄塑料的降解。