廖遠(yuǎn)璐 楊巧玲 陸有澤 陳金夏 黃章銳 馮志強(qiáng) 銀世杰 莫安勝*

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧市 530001；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西南寧市 530023)

心血管疾病是導(dǎo)致人類死亡的主要原因。為了降低心血管疾病的死亡率，需要對(duì)心血管疾病進(jìn)行研究。但在很多時(shí)候都不能以人為研究對(duì)象。因此，需要尋找能夠替代人的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。豬的心血管解剖及生理與人類較為相似且體型相對(duì)較小，是研究心血管疾病的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。心臟不停跳模型是心血管生理、病理生理、藥理及移植研究常需要建立的模型。然而，用大動(dòng)物建立心臟不停跳模型可以借鑒的經(jīng)驗(yàn)不多。本研究在原有的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上[1-3]就巴馬小型豬離體心臟非工作模型(離體空跳心臟模型)建立中灌注液鉀離子濃度進(jìn)行觀察，以期為心血管疾病的研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物與材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇體重為25～30 kg的健康成年廣西巴馬小豬5頭(廣西大學(xué)提供)；實(shí)驗(yàn)材料主要有電子秤(無錫計(jì)量器械廠)、采血袋(長(zhǎng)春泰爾茂醫(yī)用器具有限公司)、去白細(xì)胞濾器(長(zhǎng)春泰爾茂醫(yī)用器具有限公司)、動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司)、體外循環(huán)機(jī)(自行組裝)、心臟停跳液(Custodio HTK-solution，簡(jiǎn)稱HTK液)(克勒北京藥業(yè)有限公司)、生化儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 準(zhǔn)備與動(dòng)物麻醉 實(shí)驗(yàn)豬于術(shù)前禁食12 h，禁飲6 h。予實(shí)驗(yàn)豬臀部肌注阿托品0.05 mg/kg、咪達(dá)唑侖0.2 mg/kg、氯胺酮10 mg/kg[4]，待實(shí)驗(yàn)豬安靜后，于耳緣靜脈建立靜脈通道并固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，依次靜脈推注咪達(dá)唑侖0.1 mg/kg、舒芬太尼1 μg/kg、丙泊酚2 mg/kg和順阿曲庫銨0.2 mg/kg，麻醉成功后用碘伏消毒胸腹部。

1.2.2 灌注液的配置 從供血豬采取肝素化全血裝入采血袋中，經(jīng)白細(xì)胞濾器去除白細(xì)胞和血小板后裝入心臟灌注裝置。灌注液中加入紅細(xì)胞保存液、賀斯、甲基強(qiáng)的松龍、成人型復(fù)合維生素、胰島素、腎上腺素、二磷酸果糖、10%葡萄糖、10%葡萄糖酸鈣、5%碳酸氫鈉、10%氯化鉀和25%硫酸鎂。

1.2.3 離體心臟模型的建立 實(shí)驗(yàn)豬全身麻醉后進(jìn)行氣管插管，用呼吸機(jī)輔助呼吸，注意監(jiān)測(cè)呼吸和血壓。經(jīng)胸部正中切口切開心包，全身肝素化后切斷頭臂干，插入灌注管收集肝素化動(dòng)脈血。待心臟收縮減弱后開始阻斷主動(dòng)脈并灌注HTK液使心臟停跳，切斷降主動(dòng)脈起始部、主動(dòng)脈弓的兩大分支、上腔靜脈、下腔靜脈及肺靜脈，取出心臟。用生理鹽水沖洗冠脈系統(tǒng)(注意防止氣栓)及心腔后頭臂干的灌注管，連接體外循環(huán)機(jī)進(jìn)行心肌灌注。每隔1 h取灌注液進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 監(jiān)測(cè)指標(biāo) 監(jiān)測(cè)離體心臟跳動(dòng)情況，并使用生化儀檢測(cè)不同時(shí)點(diǎn)灌注液中的鉀離子濃度。

2 結(jié) 果

5例小型豬離體心臟恢復(fù)跳動(dòng)并維持空跳6 h。灌注液鉀離子濃度相對(duì)穩(wěn)定，鉀離子濃度在T0和T6時(shí)點(diǎn)濃度較高，但兩者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.881)；7個(gè)時(shí)點(diǎn)鉀離子濃度之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。不同時(shí)點(diǎn)的灌注液鉀離子濃度見表1。

表1 不同時(shí)點(diǎn)的灌注液中鉀離子濃度 (，mmol/L)

3 討 論

巴馬小型豬在解剖結(jié)構(gòu)和生理學(xué)方面與人類有較大的相似性[5]，且體型相對(duì)較小，是心血管系統(tǒng)疾病研究的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[6]。心血管生理、病理生理、藥理及移植研究常需要建立心臟不停跳模型。然而，用大動(dòng)物建立心臟不停跳模型可以借鑒的經(jīng)驗(yàn)不多。既往的實(shí)驗(yàn)中曾因未用生理鹽水清洗心腔和冠脈系統(tǒng)，出現(xiàn)灌注液高鉀導(dǎo)致離體心臟灌注后未能恢復(fù)跳動(dòng)的情況。我們總結(jié)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，并在原有的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，完成了巴馬豬離體心臟空跳模型的建立。

既往研究認(rèn)為建立心臟離體空跳模型必須安置左心室引流管[3]。但隨著對(duì)心臟離體空跳模型認(rèn)識(shí)的深入，我們發(fā)現(xiàn)未安置左心室引流管也是可行的。我們?cè)谕晟茖?shí)驗(yàn)步驟后進(jìn)行了5例小型豬離體心臟非工作模型建立的實(shí)驗(yàn)，并取得了較滿意的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)中5例小型豬離體心臟維持空跳6 h，未見心臟明顯擴(kuò)大。這可能是因?yàn)樾呐K在空跳時(shí)，回流入左心室的少量血液可以經(jīng)過二尖瓣口反流至左心房再經(jīng)過肺靜脈流到儲(chǔ)存罐，而右心室的少量回流血液可以經(jīng)肺動(dòng)脈泵出，左心房少量回流血液經(jīng)肺靜脈流出心臟，右心房少量回流血液經(jīng)腔靜脈流出心臟，因而心腔潴留的血液不多。

維持灌注液電解質(zhì)的相對(duì)穩(wěn)定對(duì)于建立離體心臟空跳模型十分重要。鉀離子是維持心肌細(xì)胞靜息電位的重要離子，還參與心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的發(fā)生。切取心臟后使用生理鹽水灌洗心腔和冠脈系統(tǒng)，可避免高鉀的HTK液進(jìn)入離體灌注循環(huán)而導(dǎo)致灌注液高鉀。本研究中5例小型豬離體心臟空跳模型的建立過程我們均用生理鹽水灌洗心腔和冠脈系統(tǒng)。灌注液鉀離子在T0和T6時(shí)濃度較高,但各時(shí)點(diǎn)鉀離子濃度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示灌注液中鉀離子濃度維持相對(duì)穩(wěn)定。T0時(shí)灌注液中鉀離子濃度較高可能是因?yàn)楣嘧⒁汉托呐K的溫度都較低，而低溫時(shí)細(xì)胞膜的鉀離子-鈉離子ATP酶活性下降，導(dǎo)致細(xì)胞外的鉀離子未能及時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。T6時(shí)灌注液中鉀離子濃度較高可能與體外循環(huán)紅細(xì)胞破壞有關(guān)，紅細(xì)胞破壞后細(xì)胞內(nèi)大量的鉀離子釋放入灌注液內(nèi)導(dǎo)致鉀離子濃度升高。此外，灌注液的酸堿度也會(huì)影響鉀離子濃度。灌注液偏酸性時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的鉀離子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，導(dǎo)致灌注液的鉀離子濃度增高；灌注液偏堿性時(shí)，細(xì)胞外的鉀離子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致灌注液的鉀離子濃度降低。

研究[3]發(fā)現(xiàn)，離體心臟空跳模型的建立除了與灌注液的鉀離子關(guān)系較大外，與灌注液的鈣離子關(guān)系也很大。鈣離子是維持正常心肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性的必要條件，也是參與心肌興奮-收縮耦聯(lián)的重要離子。而鈣離子與鉀離子一樣受到溫度以及酸堿度的影響。維持離體心臟空跳需要將血鉀離子和血游離鈣離子的比例控制在恰當(dāng)?shù)姆秶?。但?duì)于維持離體心臟空跳的最佳比例為多少、具體機(jī)理是什么，仍不得而知，這可能需要更多的研究。

綜上所述，建立離體心臟空跳模型需要維持灌注液中鉀離子濃度的相對(duì)穩(wěn)定，離體心臟保存期間無需放置左心室引流管，而切取心臟后使用生理鹽水灌洗心腔和冠脈系統(tǒng)是避免灌注液高鉀的關(guān)鍵步驟。