陳 敏， 陳 磊， 胡美忠， 張新卓， 鄔小蘭

(1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 貴州 銅仁 554300； 2.貴州大西南中藥植物科技有限公司， 貴州 銅仁 554300； 3.貴陽市扶貧開發(fā)公司， 貴州 貴陽 550081)

芽孢桿菌屬許多細(xì)菌能在代謝過程中產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，如芬薺素、伊枯草菌素和表面活性素[1]。Surfactin是脂肽表面活性劑中的一類，具有乳化及發(fā)泡能力，還具有抗細(xì)菌、病毒、腫瘤和支原體等生物活性，有用于醫(yī)藥、食品、畜牧、化妝等方面的潛力。然而當(dāng)前發(fā)酵生產(chǎn)Surfactin的產(chǎn)率較低，一定程度上限制了Surfactin在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用及研究[2-4]，故提升Surfactin的發(fā)酵產(chǎn)率同時又降低其生產(chǎn)成本，對開發(fā)利用Surfactin具有重要的現(xiàn)實意義?？莶菅挎邨U菌能發(fā)酵產(chǎn)Surfactin，且Surfactin產(chǎn)量與菌株有關(guān)[5]，也與培養(yǎng)基中的碳源、氮源、無機鹽組成等有重要關(guān)系[5-7]。近年來，許多研究人員利用響應(yīng)面法等多種方法，對脂肽類生物表面活性劑進(jìn)行了發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究[8-9]，但這些發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件不適合所有產(chǎn)surfactin的菌株。因此，針對不同菌株研究成本低廉、Surfactin發(fā)酵產(chǎn)量高的培養(yǎng)基配方及工業(yè)化發(fā)酵條件具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 枯草芽孢桿菌 枯草芽孢桿菌525為枯草芽孢桿菌S21經(jīng)紫外-鏈霉素-輻照誘變篩選的高產(chǎn)菌株?？莶菅挎邨U菌S21為銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院國家工程中心微生物實驗室篩選鑒定，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCCNo：15544)。

1.1.2 種子培養(yǎng)基 組成為酵母粉5 g、氯化鈉10 g、胰蛋白胨10 g、水1 L，pH 7.0。

1.1.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 組成為葡萄糖20 g、L-谷氨酸鈉8 g、水1 L(含MgSO40.5 g、KCl 0.5 g、KH2PO41.0 g、FeSO40.15 mg、MnSO45.0 mg、CuSO40.16 mg)，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵及Surfactin含量檢測 將保存的枯草芽孢菌用接種環(huán)劃線接種于固體種子培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)挑取一環(huán)接于100 mL液體種子培養(yǎng)基中，置于搖床中37℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)后的種子液按1%的接種量接于基礎(chǔ)培養(yǎng)基，置于搖床中37℃、200 r/min培養(yǎng)72 h。取發(fā)酵液100 mL，用4 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7，離心機8 000 r/min離心10 min，收集上清。用4 mol/L HCl將上清液調(diào)pH至2，4℃下放置12 h，8 000 r/min離心20 min，收集沉淀，甲醇抽提沉淀，0.22 μm濾膜過濾，液相檢測(色譜柱5TC-C18，波長210 nm，流速1 mL/min，時間0～20 min，流動相：90%乙腈和10%水，有機相和水相均含0.1%三氟乙酸)Surfactin的含量。

1.2.2 培養(yǎng)基單因素對Surfactin含量的影響試驗

1) 碳源。以Surfactin產(chǎn)量為指標(biāo)，選用不同碳源替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基的葡萄糖，碳源分別為葡萄糖、大米粉、玉米粉、蔗糖、淀粉、紅糖，每種碳源為20 g/L，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的其他成分不變，每個處理3次重復(fù)，通過高效液相檢測Surfactin含量，取平均值，確定最適碳源。

2) 氮源。以Surfactin產(chǎn)量為指標(biāo)，以優(yōu)選的蔗糖為碳源，代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同氮源代替L-谷氨酸鈉，其他成分不變，氮源分別為黃豆粉、酵母粉、蛋白胨、尿素、碳酸氫銨、氯化銨，每種氮源為8 g/L，每處理3次重復(fù)，通過高效液相檢測Surfactin含量，取平均值，確定最適氮源。

3) 無機鹽。以確定的最佳碳源、氮源，將培養(yǎng)基中的無機鹽硫酸鎂、氯化鉀、磷酸二氫鉀、硫酸銅、硫酸鐵、硫酸錳進(jìn)行一一缺失，確定關(guān)鍵無機鹽種類對surfactin產(chǎn)量的影響，每處理3次重復(fù)，通過高效液相檢測Surfactin含量，取平均值，確定最適無機鹽。

4) pH值。通過篩選最佳碳源、氮源及無機鹽，將培養(yǎng)基pH分別調(diào)節(jié)為6、7、8，測試pH對surfactin發(fā)酵產(chǎn)量的影響，確定最適pH值。

1.2.3 培養(yǎng)基對Surfactin產(chǎn)量影響的優(yōu)化試驗 采用3因素4水平(表1)L16(43)試驗設(shè)計研究蔗糖、尿素和無機鹽(硫酸鎂、氯化鉀、磷酸二氫鉀、硫酸銅、硫酸鐵、硫酸錳)對Surfactin產(chǎn)量的影響，篩選最適濃度組合。將枯草芽孢桿菌525活化后的種子液按1%的接種量分別接入設(shè)計的培養(yǎng)基中， 37℃、200 r/min培養(yǎng)72 h后，將發(fā)酵液去除菌體后酸沉，8 000 r/min離心20 min得沉淀，甲醇抽提沉淀中的Surfactin，通過高效液相檢測Surfactin的含量。

表1 培養(yǎng)基不同因子對Surfactin產(chǎn)量影響的水平設(shè)計

1.2.4 發(fā)酵罐驗證試驗 優(yōu)化試驗篩選得到的最佳培養(yǎng)基配方，采用100 L發(fā)酵罐進(jìn)行驗證。發(fā)酵罐裝液量為30 L，1%量接種，發(fā)酵溫度37℃，轉(zhuǎn)子速度為200 r/min，空氣流量為20 L/min，加酸堿控制pH在7左右，加消泡劑減少泡沫流失，發(fā)酵時間72 h，發(fā)酵結(jié)束后檢測發(fā)酵液中Surfactin含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Minitab 17，DPSS 7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

從表2看出，以蔗糖為碳源時，Surfactin產(chǎn)量最高，為423.96 mg/L，比葡萄糖高出61.8 mg/L，但差異不顯著，蔗糖與其他碳源相比差異極顯著。因此，選擇蔗糖作為碳源進(jìn)行下一步研究。以尿素為氮源時，Surfactin產(chǎn)量最高，為544.26 mg/L，與其他氮源相比，差異極顯著，故選擇尿素作為氮源進(jìn)行下一步研究。以蔗糖為碳源，尿素為氮源，無機鹽MgSO4、KCl、KH2PO4、CuSO4、FeSO4、MnSO一一缺失進(jìn)行篩選，當(dāng)缺失MgSO4時Surfactin產(chǎn)量最低，僅41.73 mg/L，與無機鹽未缺失比較，缺失MgSO4、KCl、KH2PO4、CuSO4、FeSO4、MnSO4對Surfactin 產(chǎn)量均有極顯著影響，表明這些無機鹽對Surfactin產(chǎn)量有重要的關(guān)系。pH 7時，Surfactin產(chǎn)量最高，為657.03 mg/L，但與pH 6、pH 8間無顯著差異。

表2 培養(yǎng)基中不同單因素下Surfactin的產(chǎn)量

2.2 優(yōu)化試驗結(jié)果

從表3看出，Surfactin產(chǎn)量最高的是第7號處理組合A2B3C4，即最佳培養(yǎng)基配方為蔗糖20 g、尿素10 g、硫酸鎂2 g、氯化鉀2 g、磷酸二氫鉀2 g、硫酸銅0.64 mg、硫酸鐵0.60 mg、硫酸錳20 mg、水1 L，pH 7.2，其Surfactin產(chǎn)量最高，為661.33 mg/L。

表3 Surfactin產(chǎn)量影響因子L16(43)正交試驗結(jié)果

經(jīng)方差分析，設(shè)置的A、B、C因素對試驗結(jié)果都有極顯著(P<0.01)影響。其中，因素A檢驗值F=12 599.35，F(xiàn)0.05(3，3)=9.280，F(xiàn)0.01(3，3)=29.500；因素B檢驗值F=11 744.37，F(xiàn)0.05(3，3)=9.280，F(xiàn)0.01(3，3)=29.500；因素C檢驗值F=1 601.48，F(xiàn)0.05(3，3)=9.280，F(xiàn)0.01(3，3)=29.500。影響Surfactin產(chǎn)量高低因素依次為B>A>C，即培養(yǎng)基中尿素對Surfactin產(chǎn)量的影響最大。

2.3 發(fā)酵罐驗證試驗結(jié)果

對篩選出的最佳培養(yǎng)基配方在100 L發(fā)酵罐發(fā)酵進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示，Surfactin產(chǎn)量為602.31 mg/L，與優(yōu)化試驗最佳培養(yǎng)基配方下的Surfactin產(chǎn)量差異不大，表明此培養(yǎng)基配方和條件的重現(xiàn)性較好。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，通過枯草芽孢桿菌525在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中發(fā)酵能產(chǎn)Surfactin，在單因素試驗基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化試驗，篩選出最佳培養(yǎng)基配方為蔗糖20 g、尿素10 g、硫酸鎂2 g、氯化鉀2 g、磷酸二氫鉀2 g、硫酸銅0.64 mg、硫酸鐵0.60 mg、硫酸錳20 mg、水1 L。利用此優(yōu)化培養(yǎng)基在pH 7.2、37℃和搖床200 r/min條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)72 h，Surfactin的產(chǎn)量達(dá)661.33 mg/L，前期采用初始基礎(chǔ)培養(yǎng)基(葡萄糖20 g、L-谷氨酸鈉8 g、MgSO40.5 g、KCl 0.5 g、KH2PO41.0 g、FeSO40.15 mg、MnSO45.0 mg、CuSO40.16 mg、水1 L，pH 7.2)培養(yǎng)，其Surfactin的產(chǎn)量為362.16 mg/L；該優(yōu)化培養(yǎng)基的Surfactin產(chǎn)量比初始培養(yǎng)基提高82.6%，并且該優(yōu)化培養(yǎng)基通過100 L發(fā)酵罐驗證，Surfactin的產(chǎn)量重現(xiàn)性好，其所需營養(yǎng)成分價格便宜，所以該優(yōu)化培養(yǎng)基適合工業(yè)化生產(chǎn)。