饒家瑞， 張 欣， 余用秀

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學院 茶葉研究所， 貴州 貴陽 550006； 2.貴州省農(nóng)業(yè)科學院 生物技術研究所， 貴州 貴陽 550006)

茶輪斑病是茶樹最嚴重的病害之一[1]，其主要危害成葉和老葉。目前，茶輪斑病的田間防治仍然以化學農(nóng)藥為主，但其農(nóng)藥殘留造成的毒素積累和代謝慢等問題已成為制約茶產(chǎn)業(yè)綠色健康發(fā)展的關鍵。近年來，生物農(nóng)藥因其可降解和低毒的特點，已成為茶園田間綠色防控茶輪斑病的新選擇[2]。有研究表明，0.5%香菇多糖對茶輪斑病菌具有較好的抑制活性，其EC50為2.68 μg/mL[3]；寧南霉素對茶假擬盤多毛孢菌菌株的EC50為75.92 U/μL[4]；諾沃霉素A在離體條件下對擬盤多毛孢(Pestalotiopsistheae)的EC50為2.11 μg/mL，在75 μg/mL和150 μg/mL濃度下對感染茶輪斑病離體葉片的防治效果分別為68.29%和100%[2]；申嗪霉素對茶輪斑病的EC50為11.23 μg/mL[5]；6%春雷霉素、枯草芽孢桿菌(100億芽孢/g)和戊唑醇430 g/L對茶輪斑病菌絲的抑制率分別為43.88%、14.29%和44.61%，對孢子萌發(fā)的抑制率分別為1.38%、46.17%和100%[6]。引起茶輪斑病的菌屬較多，茶擬盤多毛孢(P.theae)、山茶擬盤多毛孢(P.camelliae)等16種菌屬均可引起茶輪斑病[7-8]，用藥難度較大，防控也因地區(qū)不同、病菌種類差異等問題一直困擾著精準用藥。因此，為精準防控貴州地區(qū)發(fā)生的茶輪斑病，用5種生物農(nóng)藥對貴州茶園采樣鑒定后的病原菌進行抑菌活性篩選，以期為貴州茶園茶輪斑病的防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病原菌 茶輪斑病病原菌由張欣等[9]于2020年7月從貴州省銅仁市石阡縣采集，經(jīng)形態(tài)學、分子生物學和毒性回接實驗等鑒定該病菌為茶輪斑病病原(Pestalotiopsistrachicarpicola)，由貴州省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所提供。

1.1.2 藥劑 寡糖-乙蒜素、嘧啶核苷類抗菌素等5種生物農(nóng)藥的名稱、成分含量、劑型及生產(chǎn)廠家見表1。無水乙醇，購于天津市富宇精細化工有限公司；吐溫80，購于天津市大茂化學試劑廠；土豆培養(yǎng)基(PDA)，購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其他試劑均購于上海安耐吉化學試劑有限公司。藥品稱量，均在Sarfori-us型電子天平(精度:0.001 g)上完成。

表1 5種生物農(nóng)藥的名稱、成分含量、劑型及生產(chǎn)廠家

1.1.3 儀器 超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)；電熱鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)；高溫蒸汽滅菌鍋(上海沉匯儀器有限公司)；BSA224S-CW電子天平；BHC-1300II A/B3生物潔凈安全柜；Mill-Q型超純水儀；20～200 μL、100～1 000 μL和1～5 mL移液槍等儀器。

1.2 試驗設計

試驗共設7個處理，根據(jù)生物農(nóng)藥的相應編號分設為處理1～處理5，處理6為對照藥劑春雷霉素(有效成分2%，水劑/低毒，乳山韓威生物科技有限公司，CK1)，處理7為空白對照等量吐溫80滅菌水(CK2)。每處理3次重復，隨機排列。

1.3 試驗方法

1.3.1 5種生物農(nóng)藥抗茶輪斑病的生物活性初篩

1) PDA培養(yǎng)基的配制。稱量洗凈去皮的土豆400 g放于鍋中，加入2.5 L清水，煮開10 min?；?，冷卻10 min，然后用網(wǎng)布過濾掉土豆殘渣，將土豆汁液與40 g瓊脂、40 g葡萄糖、6 g磷酸二氫鉀、3 g硫酸鎂和20 mg維生素 B1混合均勻，最后以每瓶45 mL倒入100 mL的錐形瓶中封口，在121℃條件下高壓滅菌 20 min，冷卻備用。

2) 藥液配制。在200 mL滅菌水中加入200 μL吐溫80，攪拌均勻。在10 mL離心管中分別加入吐溫80滅菌水1 mL，將5種生物農(nóng)藥分別稱取5 mg分別溶解到離心管中，待其溶解均勻后再加入滅菌水4 mL，使其最終體積為5 mL。藥液用PDA培養(yǎng)基45 mL混勻，使生物農(nóng)藥的最終質(zhì)量濃度為100 μg/mL。將含有待測生物農(nóng)藥的PDA培養(yǎng)基平均倒入3個培養(yǎng)皿中冷卻備用。

3) 病菌接種。將活化好的輪斑病病菌置于超凈工作臺，用打孔器于菌餅邊緣打孔，制成直徑為 4.0 mm的菌餅，然后用無菌接種針按試驗設計要求將菌餅接種到含有各生物農(nóng)藥的培養(yǎng)基中。最后將培養(yǎng)皿放于25℃、80%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。待空白對照組生長至6.0 cm左右時，采用十字交叉法測試菌餅直徑[12]，計算其抑制率(I)，篩選出抗茶輪斑病活性較高的生物農(nóng)藥。

I=[(C-T)/(C-0.4)]×100%

式中，C為空白對照菌絲測量直徑，T為藥物處理組測量直徑。

1.3.2 活性較高生物農(nóng)藥抗茶輪斑病的EC50測定 根據(jù)5種生物農(nóng)藥對茶輪斑病抑制活性的初篩結(jié)果，在濃度100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL和6.75 μg/mL條件下，測定抑制活性較高生物農(nóng)藥的EC50，藥劑對照(CK1)為春雷霉素50～800 μg/mL、空白對照(CK2)為等量吐溫80滅菌水。利用菌絲生長速率法測定抑菌活性，采用十字交叉法測量生長后的菌絲直徑，并計算抑制率，再對生物農(nóng)藥濃度取對數(shù)與其相應抑制率進行線性回歸分析，從而得出EC50。根據(jù)EC50判斷生物農(nóng)藥的毒力大小，即生物農(nóng)藥的EC50越小，對茶輪斑病病原菌的毒力越小。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和DPS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種生物農(nóng)藥對茶輪斑病的抑制活性

從表2可知，在100 μg/mL濃度下，5種生物農(nóng)藥對茶輪斑病菌的抑制率以處理1最高，為78.74%；處理4其次，為67.48%；處理5第三，為58.72%；處理3最低，為4.32%；CK1為18.70%，除比處理3高外均低于其余處理，各處理的抑制率差異均達極顯著。說明，寡糖-乙蒜素、香菇多糖、申嗪霉素和嘧啶核苷類抗菌素4種生物農(nóng)藥對茶輪斑病菌的抑制活性均優(yōu)于對照春雷霉素，其中以寡糖-乙蒜素、香菇多糖的效果最好。

表2 不同生物農(nóng)藥抗茶輪斑病菌活性的抑制率

2.2 寡糖-乙蒜素、香菇多糖對茶炭疽病的抑制率及EC50

2.2.1 抑制率 從表3可知，寡糖-乙蒜素、香菇多糖和春雷霉素在各濃度下對茶輪斑病菌的抑制率均達極顯著差異，在試驗濃度下均隨藥劑濃度減小對茶輪斑病的抑制率呈極顯著減小趨勢。在各濃度下抗茶輪斑病菌的抑制率以寡糖-乙蒜素最佳，濃度6.75～100 μg/mL的抑制率在20.20%～79.13%，比同梯度濃度下香菇多糖的抑制率分別高6.76百分點、12.28百分點、11.66百分點、12.26百分點和9.82百分點。寡糖-乙蒜素和香菇多糖在各濃度下的抑制活性均高于對照藥劑春雷霉素，其抑制率和對應藥物濃度均呈較好的線性關系，測定的EC50值可信度高。

表3 寡糖-乙蒜素、香菇多糖不同濃度對茶輪斑病活性的抑制率

2.2.2EC50從表4可知，寡糖-乙蒜素、香菇多糖的毒力回歸方程的相關系數(shù)均>0.95，說明濃度與抑制率間均存在良好的線性關系。寡糖-乙蒜素和香菇多糖的EC50分別為25.32 μg/mL和43.31 μg/mL，分別比對照藥劑春雷霉素的EC50(396.17 μg/mL)減少用藥量370.85 μg/mL和352.86 μg/mL。說明，寡糖-乙蒜素對茶輪斑病的毒力強度最大，香菇多糖其次，寡糖-乙蒜素、香菇多糖抗茶輪斑病的效果均優(yōu)于對照藥劑春雷霉素。

表4 寡糖-乙蒜素、香菇多糖對茶輪斑病病原菌的毒力回歸方程及EC50

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，在100 μg/mL濃度下，寡糖-乙蒜素、嘧啶核苷類抗菌素、丁子香酚、香菇多糖和申嗪霉素5種生物農(nóng)藥對茶輪斑病的抑制率，除丁子香酚外，其余4種均優(yōu)于對照藥劑春雷霉素(18.70%)，其中，以寡糖-乙蒜素的抑制率最高，為78.74%；香菇多糖其次，為67.48%，表明寡糖-乙蒜素和香菇多糖對茶輪斑病的抑制活性較佳。寡糖-乙蒜素、香菇多糖的EC50分別為25.32 μg/mL、43.31 μg/mL，分別比對照春雷霉素的EC50(396.17 μg/mL)減少用藥量370.85 μg/mL和352.86 μg/mL。說明，寡糖-乙蒜素對茶輪斑病的毒力強度最大，香菇多糖其次，生產(chǎn)上防治茶輪斑病建議使用寡糖-乙蒜素。