李玉潔 陳 燕 楊宏志 李永偉 李 躍 張炯善 鄒增城

中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 (廣東 廣州， 510630)

肝細(xì)胞癌(HCC)是一種具有多種危險(xiǎn)因素的惡性腫瘤疾病，是原發(fā)性肝癌的主要病理類型。目前HCC的常用治療方法有手術(shù)切除術(shù)、經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)、射頻消融、分子靶向治療、肝移植。中西醫(yī)結(jié)合治療越來(lái)越受到重視。明·李中梓在《醫(yī)宗必讀·積聚》中創(chuàng)制了一首癥積通用方：陰陽(yáng)攻積丸，是治五積、六聚、七癥、八瘕、痃癖、蟲(chóng)積、痰食的良方[1]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門新興學(xué)科，為中藥方劑的研究提供了新的方法[2]，可從整體上展示藥物靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)[3]；使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)理解藥物的多重藥理作用和藥物對(duì)生物網(wǎng)絡(luò)的影響也具有重要意義[4]。筆者利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討陰陽(yáng)攻積丸治療HCC的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 中藥復(fù)方活性成分及其作用靶點(diǎn)的收集和篩選 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/) 分別檢索陰陽(yáng)攻積丸中20味中藥。TCMSP是一個(gè)提供有關(guān)中草藥成分的全面信息的數(shù)據(jù)庫(kù)，如化學(xué)結(jié)構(gòu)、口服生物利用度、腸上皮通透性、水溶性、藥物相似性、藥物靶點(diǎn)以及它們與疾病的關(guān)系[5]，也包括吸收、分布、代謝和排泄(ADME)在內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特性。本研究采用口服生物利用度(OB)和藥物相似度(DL)2個(gè)ADME相關(guān)參數(shù)來(lái)預(yù)測(cè)陰陽(yáng)攻積丸潛在的活性成分。OB被廣泛用于評(píng)價(jià)藥物克服吸收障礙進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)的能力，是通過(guò)計(jì)算藥物與細(xì)胞色素P450和P-糖蛋白的關(guān)系來(lái)確定的[6]，OB值≥30%的患者口服后吸收良好。DL通過(guò)計(jì)算與已知藥物的相似度來(lái)表示潛在成分成為有效藥物的能力，值不小于0.18，表明該化合物在化學(xué)上適合藥物開(kāi)發(fā)[7]。因此，以O(shè)B≥30%和DL≥0.18作為活性成分在陰陽(yáng)攻積丸中的納入標(biāo)準(zhǔn)，并收集其作用的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2 肝細(xì)胞癌相關(guān)靶標(biāo)基因的獲取及收集 GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)是一個(gè)人類基因相關(guān)的綜合數(shù)據(jù)庫(kù)[8]，OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)是在線人類孟德?tīng)栠z傳，包括對(duì)人和動(dòng)物所有生物有關(guān)基因進(jìn)行記載。在兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入關(guān)鍵詞“hepatocellular carcinoma”或“HCC”進(jìn)行檢索，獲取肝癌相關(guān)靶點(diǎn)基因。

1.3 藥物-疾病共同靶點(diǎn)確定 通過(guò)繪圖軟件venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)分別錄入陰陽(yáng)攻積丸中活性成分相關(guān)的靶點(diǎn)與HCC的靶點(diǎn)，篩選出兩者的共同靶點(diǎn)基因，作為陰陽(yáng)攻積丸治療HCC的潛在作用靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖(venn)。再運(yùn)用Cytoscape 3.6構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，使二者靶點(diǎn)作用關(guān)系可視化。Cytoscape是一個(gè)網(wǎng)絡(luò)可視化和分析的軟件，將相互聯(lián)系的事物、其間錯(cuò)綜復(fù)雜的作用關(guān)系呈現(xiàn)可視化，運(yùn)用計(jì)算機(jī)科學(xué)算法對(duì)網(wǎng)絡(luò)性質(zhì)進(jìn)行分析，且聯(lián)合大的數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)生物網(wǎng)絡(luò)參數(shù)綜合評(píng)價(jià)，綜合生物信息學(xué)理論對(duì)分子生物功能進(jìn)行注釋[9]。在生成的網(wǎng)絡(luò)中，每個(gè)節(jié)點(diǎn)(node)代表著基因、蛋白質(zhì)或分子, 而節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間連接的邊(edge)代表著這些生物分子之間的相互作用關(guān)系。

1.4 蛋白之間互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的確定 將藥物-疾病共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/Version11.0)，設(shè)置蛋白種類為“homo sapiens”，獲得蛋白互作關(guān)系圖。排除邊緣游離蛋白，將最高置信度蛋白質(zhì)參數(shù)評(píng)分值設(shè)置為>0.4，并將結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出以便后續(xù)的分析。通過(guò)R語(yǔ)言軟件計(jì)算得出核心靶點(diǎn)，依據(jù)蛋白互作次數(shù)，確定核心靶點(diǎn)蛋白。

1.5 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析 為了說(shuō)明中藥化合物對(duì)應(yīng)的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)在基因功能和通路中的作用，采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白質(zhì)進(jìn)行基因本體論(GO)生物學(xué)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。GO是根據(jù)現(xiàn)有研究對(duì)各種生物基因和蛋白質(zhì)功能進(jìn)行限定和描述，主要包括：細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)和生物過(guò)程(BP)3大模塊。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)是基于基因組測(cè)序和其他髙通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)從基因水平系統(tǒng)描述高級(jí)生物功能和生物系統(tǒng)(如細(xì)胞、生物和生態(tài)系統(tǒng))的實(shí)用程序數(shù)據(jù)庫(kù)資源[10]。

2 結(jié)果

2.1 陰陽(yáng)攻積丸候選活性成分與候選靶點(diǎn) 通過(guò)對(duì)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索和篩選一共收集到226個(gè)化學(xué)成分，其中重復(fù)38個(gè)，保留唯一的188個(gè)候選活性成分見(jiàn)表1。同時(shí)針對(duì)每個(gè)有效活性成分，獲取陰陽(yáng)攻積丸中的潛在作用靶標(biāo)，去除無(wú)效和重復(fù)后得到878個(gè)。根據(jù)組方君臣佐使原則，利用韋恩圖分析活性化合物及其靶點(diǎn)在陰陽(yáng)攻積丸中的分布，見(jiàn)圖1。

圖1 活性化合物在陰陽(yáng)攻積丸中的分布(A) 潛在靶點(diǎn)在陰陽(yáng)攻積丸中的分布(B)

表1 陰陽(yáng)攻積丸的活性成分(DL值前10)

2.2 陰陽(yáng)攻積丸抗癌的潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 經(jīng)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索收集并去重后，得到HCC疾病的潛在作用靶點(diǎn)7 100個(gè)。運(yùn)用venny軟件得到藥物活性成分相關(guān)的靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的共同靶點(diǎn)基因110個(gè)，作為陰陽(yáng)攻積丸治療HCC的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)；并導(dǎo)入U(xiǎn)niProt 數(shù)據(jù)庫(kù)經(jīng)Target-ID配對(duì)獲取這些靶點(diǎn)基因相對(duì)應(yīng)的UniProt ID，見(jiàn)表2。

表2 陰陽(yáng)攻丸潛在作用靶標(biāo)信息

2.3 GO功能富集分析 采用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)110個(gè)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO基因本體分類富集分析，結(jié)果顯示，生物過(guò)程確定了123個(gè)GO條目，前20個(gè)條目主要涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性(DNA-binding transcription activator activity), RNA聚合酶II特異性(RNA polymerase II-specific)、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin-like protein ligase binding)、核受體活性(nuclear receptor activity)、類固醇激素受體(steroid hormone receptor activity)、血紅素結(jié)合(heme binding)、類固醇結(jié)合(steroid binding)和半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性與細(xì)胞凋亡(cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process)等過(guò)程。表明陰陽(yáng)攻積丸可以通過(guò)參與調(diào)控大量不同類型的生物學(xué)過(guò)程而發(fā)揮抗癌作用。用R語(yǔ)言繪制高級(jí)氣泡圖，其中縱坐標(biāo)代表GO條目名稱，橫坐標(biāo)代表基因的比例，即陰陽(yáng)攻積丸中有治療肝癌作用的110個(gè)基因富集在該條GO條目上的個(gè)數(shù)與富集在該條GO條目上的總基因個(gè)數(shù)的比值；氣泡大小代表基因個(gè)數(shù)，氣泡越大，表示富集在該條GO條目上的基因個(gè)數(shù)越多，氣泡的顏色代表P值，顏色越紅，富集的程度越高，P值越小。見(jiàn)圖2。

圖2 GO功能富集分析氣泡圖

2.4 KEGG通路富集分析 采用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出的110個(gè)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，從KEGG富集分析結(jié)果共確定116條信號(hào)通路。富集基因數(shù)的前20條通路：乙型肝炎(Hepatitis B)、PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、細(xì)胞凋亡(Apoptosis)、TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、p53信號(hào)通路(p53 signaling pathway)、癌癥中的蛋白多糖(Proteoglycans in cancer)、癌癥中的MicroRNAs(MicroRNAs in cancer)甲狀腺激素信號(hào)通路(Thyroid hormone signaling pathway)等，即陰陽(yáng)攻積丸治療肝癌的核心靶點(diǎn)主要通過(guò)以上通路起作用。用R語(yǔ)言繪制高級(jí)氣泡圖，直觀的表明陰陽(yáng)攻積丸活性成分的靶點(diǎn)分布于多種通路。其中縱坐標(biāo)代表KEGG名稱，橫坐標(biāo)代表基因比例，即陰陽(yáng)攻積丸中有治療肝癌作用的110個(gè)基因富集在該條KEGG通路上的個(gè)數(shù)與富集在該條KEGG通路上的總基因個(gè)數(shù)的比值；氣泡大小代表基因個(gè)數(shù)，氣泡越大，表示富集在該條KEGG通路上的基因個(gè)數(shù)越多，氣泡的顏色代表P值，顏色越紅，富集的程度越高，P值越小見(jiàn)圖3。

圖3 KEGG通路富集分析氣泡圖

2.5 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運(yùn)用Cytoscape 3.6.0構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”相互作用的可視化網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖4，該網(wǎng)絡(luò)包含247個(gè)節(jié)點(diǎn)和871條邊,其中桔色長(zhǎng)方形代表藥物,黃色三角形代表成分，綠色橢圓形代表靶點(diǎn)蛋白,藍(lán)色菱形代表疾病，邊代表相互關(guān)系。其中Degree值較大的活性成分有槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、黃芩素(baicalein)、異鼠李素(isorhamnetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)等，通過(guò)此網(wǎng)絡(luò)驗(yàn)證了陰陽(yáng)攻積丸治療肝細(xì)胞癌是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)的方式發(fā)揮作用的。

圖4 陰陽(yáng)攻積丸治療肝癌的“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”

2.6 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及陰陽(yáng)攻積丸作用于肝癌核心蛋白的確定通過(guò)STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)在線構(gòu)建PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)圖，設(shè)置蛋白種類為“homo sapiens”，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖5，該網(wǎng)絡(luò)共有110個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 153條邊，PPI enrichment p-value<1.0e-16。其中每個(gè)節(jié)點(diǎn)就是靶點(diǎn)蛋白，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間連接的邊表示靶點(diǎn)蛋白之間的相互作用，邊越多表示靶點(diǎn)間的作用關(guān)系越強(qiáng)。藍(lán)色邊來(lái)自數(shù)據(jù)庫(kù)收集的蛋白作用關(guān)系，粉色邊則來(lái)自實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。在Setting模塊將最高置信度蛋白質(zhì)參數(shù)評(píng)分值設(shè)置為>0.4,同時(shí)設(shè)置隱藏游離蛋白后導(dǎo)出TSV格式文件，用R語(yǔ)言軟件運(yùn)算得到核心靶點(diǎn)，篩選p值最小的前30個(gè)繪制 barplot條形圖見(jiàn)圖6，即陰陽(yáng)攻積丸中的 IL6、VEGFA、EGFR、CASP3、MAPK8、MYC等可能是作用于肝癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖5 陰陽(yáng)攻積丸治療肝癌相關(guān)基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖6 PPI圖中的靶點(diǎn)排序(排名前 30)

3 討論

晚期肝癌患者主要依靠靶向藥物治療，但帶來(lái)的毒副作用以及對(duì)藥物產(chǎn)生的耐藥性使我們尋找新的HCC治療藥物和治療策略具有重要意義。與西藥“一靶一藥”不同，由于中藥成分的復(fù)雜性，其多種成分和靶點(diǎn)的協(xié)同作用，在治療HCC方面顯示出優(yōu)勢(shì)[11]。將系統(tǒng)生物學(xué)與計(jì)算機(jī)技術(shù)相結(jié)合的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，已成為從分子水平到通路水平描述復(fù)雜中藥復(fù)方作用機(jī)制的有用工具，是研究中醫(yī)藥作用機(jī)制和開(kāi)發(fā)新藥前期高效的預(yù)測(cè)方法[12]。本研究通過(guò)構(gòu)建陰陽(yáng)攻積丸“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，從多個(gè)角度探索陰陽(yáng)攻積丸治療HCC的潛在分子機(jī)制。

本研究所收集的陰陽(yáng)攻積丸治療HCC的有效成分有188個(gè)，通過(guò)“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)，槲皮素、山奈酚、木犀草素、黃芩素、異鼠李素等可能是本方發(fā)揮作用的重要活性化合物。槲皮素是一種天然黃酮類化合物，通過(guò)抑制PI3K通路來(lái)達(dá)到抗癌作用[13]，它已被證實(shí)可誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與PTEN的過(guò)表達(dá)抑制AKT活化有關(guān)[14]。山奈酚是一種廣泛存在于水果和蔬菜中的膳食類黃酮，因其具有抗腫瘤作用而受到重視。Guo等[15]研究發(fā)現(xiàn)山奈酚通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激CHOP信號(hào)通路促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡，Zhu等[16]則發(fā)現(xiàn)山奈酚通過(guò)使PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路失活來(lái)抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。木犀草素在20μM濃度下可以引起HepG2細(xì)胞周期滯留在G2/M期, 通過(guò)阻滯其生長(zhǎng)周期進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[17]。黃芩素能抑制INF-γ誘導(dǎo)的SMMC-7721和HepG2細(xì)胞的PD-L1表達(dá)，從而恢復(fù)T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的敏感性，抑制腫瘤的生長(zhǎng)[18]。異鼠李素一種從中藥甘草中提取的黃酮苷元，被證明具有體外抗肝癌細(xì)胞的活性[19]，Choi[20]首次發(fā)現(xiàn)異鼠李素通過(guò)將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期來(lái)抑制人肝癌Hep3B細(xì)胞的增殖。我們前期實(shí)驗(yàn)采用高效液相檢測(cè)到陰陽(yáng)攻積丸含有異鼠李素，可能是該方的抗癌成分之一[21]。因此，初步可推測(cè)以上化合物很可能是陰陽(yáng)攻積丸治療HCC的相關(guān)藥效物質(zhì)。

此外，通過(guò)分析陰陽(yáng)攻積丸抗HCC的110個(gè)共同靶點(diǎn)構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素-6(IL-6)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(CASP3)、絲裂原激活蛋白激酶8(MAPK8)和MYC是計(jì)算度最高的核心基因。IL-6是一種在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用的促炎細(xì)胞因子，He等[22]研究發(fā)現(xiàn)HCC中高表達(dá)IL-6與肝癌的惡性進(jìn)展關(guān)系密切。VEGFA是較強(qiáng)的促血管生長(zhǎng)因子，在腫瘤發(fā)展過(guò)程中具有重要作用，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、增加細(xì)胞外基質(zhì)合成，是抗腫瘤血管生成藥物治療的重要靶點(diǎn)[23]。EGFR是上皮生長(zhǎng)因子(EGF)細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)的受體,HCC組織中EGFR的表達(dá)顯著高于癌旁組織[24]。CASP3是細(xì)胞凋亡的一種檢測(cè)指標(biāo)，它可通過(guò)抑制p38活化和肝細(xì)胞凋亡來(lái)預(yù)防化學(xué)誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生[25]。MAPK8又被稱為c-Jun氨基末端激酶1(JNK1), 是MAPKs家族的重要成員之一，Sakurai等[26]研究發(fā)現(xiàn)JNK1可上調(diào)VEGFA的表達(dá)來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和血管生成。Hui[27]也發(fā)現(xiàn)JNK1可影響p21和c-Myc的表達(dá)促進(jìn)人肝癌細(xì)胞的增殖。MYC是較早發(fā)現(xiàn)的一組癌基因，有研究發(fā)現(xiàn)MYC癌基因的失活足以誘導(dǎo)浸潤(rùn)性肝癌的持續(xù)消退[28]；我們之前的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，10%陰陽(yáng)攻積丸含藥血清能顯著下調(diào)MHCC97H和HepG2細(xì)胞的c-Myc表達(dá)[29]。

通過(guò)KEGG通路富集分析可發(fā)現(xiàn)，陰陽(yáng)攻積丸主要干預(yù)了Hepatitis B、PI3K-Akt、TNF、MAPK、p53等信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌的調(diào)控。HBV感染是HCC發(fā)生的重要誘因，抗病毒治療可降低患者乙肝病毒載量、抑制病毒復(fù)制、延緩肝硬化的進(jìn)展，從而減少乙型肝炎相關(guān)性肝癌的發(fā)生。Liu等[30]研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中Akt的表達(dá)明顯高于正常肝組織，中藥可通過(guò)干預(yù)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)[31]，因此，PI3K/Akt通路可成為治療肝癌的靶點(diǎn)。TNF是腫瘤微環(huán)境中重要的炎性細(xì)胞因子，包括TNF-α和TNF-β；在肝癌的發(fā)展中有著重要作用，顧星等[32]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)影響TNFα/NF-κB信號(hào)通路活化,可抑制肝癌細(xì)胞增殖。MAPK信號(hào)通路的異常活化在乙型肝炎相關(guān)性肝癌中發(fā)揮的重要作用[33]。有研究發(fā)現(xiàn)HBX可以通過(guò)抑制EphA2的表達(dá)阻斷p38MAPK和ERK1/2信號(hào)通路，減少了HBV的復(fù)制，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[34]。腫瘤抑制因子P53是一種轉(zhuǎn)錄因子, 在調(diào)控細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和衰老中發(fā)揮重要的作用，研究結(jié)果表明黃芪蛋白、藤茶總黃酮等活性成分都是通過(guò)激活p53信號(hào)通路發(fā)揮抗肝癌的治療作用[35,36]。富集結(jié)果涵蓋了多個(gè)腫瘤信號(hào)通路，因此推測(cè)陰陽(yáng)攻積丸可從多方面干預(yù)調(diào)控肝癌發(fā)展。

綜上所述，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)和多途徑的治療作用，初步明確了陰陽(yáng)攻積丸治療肝癌的潛在作用機(jī)制，通過(guò)構(gòu)建的“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，為陰陽(yáng)攻積丸臨床用藥提供了理論依據(jù)。由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法有一定局限性，后續(xù)研究需要選取活性成分對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。