邱輝

（新泰市人民醫(yī)院腫瘤二科，山東 泰安 271200）

結腸癌是發(fā)病率、死亡率均較高的消化道惡性腫瘤[1]。我國是結腸癌的高發(fā)國家之一，2012年有新發(fā)結直腸癌24.5萬例及13.9萬例結直腸癌相關死亡病例[2-3]，結腸癌易發(fā)生轉移是導致死亡率較高的重要原因。結腸癌的侵襲和轉移涉及多個細胞內、外因素，腫瘤細胞的細胞骨架成分肌動蛋白結合蛋白可能是其中一個重要因素[4]。FSCN1是一種進化上保守的肌動蛋白結合蛋白，參與細胞突起形成與細胞絲狀偽足的形成過程，與腫瘤的生長與轉移密切相關[5-6]。FSCN1可以促使腫瘤細胞發(fā)生上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），而EMT在腫瘤的侵襲與轉移中具有重要作用[7-8]。FSCN1是否通過促進結腸癌細胞的EMT過程進而導致結腸癌侵襲轉移，目前尚未見相關報道。Vimentin（波形蛋白）是EMT的標志蛋白，因此，檢測人結腸癌及癌旁組織中FSCN1與Vimentin的表達情況，并進一步研究結腸癌細胞中FSCN1與Vimentin的調控關系，可為闡明結腸癌的轉移機制提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗資料 人結腸癌細胞株SW-480細胞購自中科院上海細胞庫。兔抗人FSCN1抗體（Abcam）、兔抗人Vimentin（CST）、FSCN1-siRNA（Santa Cruz）、Control-siRNA（Santa Cruz）、Lipo6000TM轉染試劑（碧云天公司）、SABC免疫組化試劑盒（博士德）、Transwell小室（Corning公司）、Matrigel膠（BD公司）。人結腸癌組織芯片購自西安艾麗娜公司，人結腸癌組織芯片含有結腸癌原發(fā)灶和對應癌旁組織，所有患者術前均未行化療和放療。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 SABC法檢測結腸癌及癌旁組織中FSCN1與Vimentin的表達情況，具體步驟參照SABC試劑盒說明書進行。采用兩級評分法，①陽性細胞計數(shù)：＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。②染色強度分級：無染色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕色為3分。當兩級評分乘積＞4時為陽性表達。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及轉染 細胞培接種于六孔板中，在5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞轉染于六孔板中進行，細胞密度達30%左右，進行FSCN1-siRNA、Control-siRNA轉染，具體步驟參考Lipo6000?轉染試劑說明書。

1.2.3 實時定量PCR Trizol法提取結腸癌SW-480細胞中RNA，測定RNA濃度，逆轉錄成cDNA，實時定量PCR檢測，反應條件：50℃2 min，95℃10 min；95℃0.5 min，60℃0.5 min，40個循環(huán)。運行溶解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進行分析。FSCN1的引物為5’-GCCAGGGTATGGACCTGTCTG-3’和5’-CACGCCACTC GA TG TC AA AGTA-3’，Vimentin的引物為5’-AAATGGCTCGTCACCTTC-3’和5’-AC CTGAGGCTTTGGATTCCT-3’，內參β-actin的引物為5’-AGCGAGCAT CCCCCAAAGTT-3’和5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’。

1.2.4 蛋白質免疫印跡 提取細胞總蛋白，BCA法測定細胞蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液后100℃變性5 min。進行SDS-PAGE蛋白電泳、轉膜、10%脫脂奶封閉、一抗4℃孵育過夜、二抗室溫孵育1 h、熒光顯色。采用Image J軟件分析灰度值。

1.2.5 Transwell遷移與侵襲實驗 Transwell遷移實驗：將200μL無血清培養(yǎng)基稀釋的細胞（約5萬個）加入小室上層，下室加入600μL含血清的培養(yǎng)液；侵襲實驗：小室鋪有Matrigel膠，將200μL無血清培養(yǎng)基稀釋的細胞（約2萬個）加入小室上層；培養(yǎng)24 h，取出小室，多聚甲醛固定，結晶紫染色，顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以“±s”表示，組間比較采用t檢驗，3組間比較行單因素F分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，相關性采用Spearman分析，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組FSCN1與Vimentin蛋白的表達情況 FSCN1主要表達于細胞質，其在結腸癌組織中的表達陽性率為51.1%（46/90），而在癌旁組織中無表達，差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=69.791，P＜0.001）；Vimentin主要表達于細胞質和細胞核，其在結腸癌組織中的表達陽性率為62.2%（56/90），而癌旁組織中陽性率為20.0%（18/90），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=33.136，P＜0.001），見圖1。

圖1 FSCN1與Vimentin在結腸癌及癌旁組織中的表達情況Figure 1 The expression of FSCN1 and Vimentin in colon cancer and adjacent tissues

2.2 FSCN1與Vimentin在結腸癌組織中的表達及與臨床病理參數(shù)的關系 FSCN1在結腸癌組織中的表達與性別、年齡無關，與TNM分期、淋巴結轉移、分化程度呈正相關；Vimentin在結腸癌組織中的表達與性別、年齡無關，與TNM分期、淋巴結轉移、分化程度呈正相關，見表1。

表1 FSCN1、Vimentin在結腸癌組織中的表達及與臨床病理參數(shù)的關系Table 1 The expression of FSCN1 and Vimentin in colon cancer and their relationship with clinicopathological parameters

2.3 結腸癌組織中FSCN1與Vimentin表達的相關性FSCN1與Vimentin在結腸癌中共同表達陽性者44例，共同表達陰性者32例，F(xiàn)SCN1表達陽性而Vimentin表達陰性者2例，F(xiàn)SCN1表達陰性而Vimentin表達陽性者12例，兩者在結腸癌組織中的表達均呈顯著正相關（r=0.705，P＜0.001）。

2.4 SW-480細胞中，F(xiàn)SCN1對Vimentin mRNA及蛋白表達水平的影響 Real time-PCR結果顯示，SW-480細胞轉染FSCN1-siRNA后，F(xiàn)SCN1 mRNA、Vimentin mRNA水平均明顯降低，而Blank組（空白組）與Control-siRNA組無明顯變化（F=18.88，P=0.003；F=12.073，P=0.008），見圖2。

Western blot結果顯示，SW-480細胞轉染FSCN1-siRNA后，F(xiàn)SCN1、Vimentin蛋白表達水平均明顯降低，而Blank組與Control-siRNA組無明顯變化（F=10.531，P=0.011；F=9.43，P=0.014），見圖2。

圖2 FSCN1對Vimentin的mRNA與蛋白表達的影響Figure 2 Effect of FSCN1 on Vimentin mRNAand protein expression

2.5 Transwell遷移與侵襲實驗 人結腸癌SW-480細胞分別轉染FSCN1-siRNA與Control-siRNA 24 h后，與ControlsiRNA組比較，F(xiàn)SCN1-siRNA組細胞的遷移、侵襲能力均明顯降低（t=4.189，P=0.014；t=-5.143，P=0.007），見圖3。

圖3 敲低FSCN1的表達后對SW-480細胞運動能力的影響Figure 3 Effect of knockdown of fscn1 expression on motility of SW-480 cells

3 討論

我國作為結腸癌的高發(fā)國家之一，大部分患者確診時已發(fā)生淋巴結或者其他臟器轉移，進而失去最佳手術時機。因此，闡明結腸癌細胞的轉移機制對于結腸癌的診治具有重要意義。如果發(fā)生浸潤與轉移，腫瘤細胞需要具備一定的運動和侵襲能力，并有相應的形態(tài)特征（如伸長、極化、細胞突起的出現(xiàn)等）及細胞之間連接的紊亂[9]。所有上述改變均與細胞骨架（尤其肌動蛋白）的改變和重排有關[10]。作為一種肌動蛋白結合蛋白，F(xiàn)SCN1與腫瘤細胞的絲狀偽足形成、細胞粘附及運動遷移等生物學行為有關，進而影響結腸癌等多種腫瘤細胞的侵襲轉移[11]。目前FSCN1在結腸癌轉移中涉及的具體分子機制尚不明確。

EMT是指上皮細胞在相關因子的刺激下向間質細胞表型轉化的過程，上皮細胞發(fā)生EMT化后具有間質細胞特性，通過EMT過程，腫瘤細胞可以獲得較高遷移、侵襲與降解細胞外基質的能力，從而誘導腫瘤的浸潤和轉移[12-13]。EMT對于結腸癌發(fā)生和發(fā)展至關重要，且與結腸癌細胞侵襲轉移密切相關[14]。研究證實，F(xiàn)SCN1可以誘導膽管癌細胞的EMT化及參與人鼻咽癌細胞CNE-2的EMT過程[15-16]。因此，推測FSCN1可能通過誘導結腸癌細胞EMT進而促進結腸癌細胞侵襲與轉移。Vimentin是EMT化的重要分子標志物，表達上調后腫瘤細胞遷移運動和侵襲能力明顯增強，參與了腫瘤侵襲轉移等惡性表型[17]。

本研究結果顯示，F(xiàn)SCN1與Vimentin在結腸癌組織中均呈高表達，且與腫瘤的TNM分期、淋巴結轉移均呈正相關，說明二者可能與結腸癌轉移有關，且兩種蛋白在結腸癌組織中表達呈正相關，因此，進一步用siRNA敲低人結腸癌細胞SW-480中的FSCN1表達后發(fā)現(xiàn)Vimentin的mRNA與蛋白表達水平明顯降低，進而證實了在結腸癌細胞中FSCN1對Vimentin具有正向調控作用。細胞實驗也證實FSCN1與結腸癌細胞的侵襲與轉移有關，從而推測出FSCN1通過調控結腸癌細胞的EMT進而促進了結腸癌細胞的轉移，為結腸癌的診治提供了新的思路。