王娟娟，閆會萍,2，杜樂，宋小波，陸一帆,2,*

1. 北京體育大學運動醫(yī)學與康復學院，北京 100084 2. 國家體育總局運動應激與適應重點實驗室，北京 100084 3. 華中師范大學體育學院，武漢 430079

二噁英類化合物(doxin-like compounds, DLC)是一種普遍存在的親脂性持久性有機污染物(persistent organic pollutants, POPs)，其在人體半衰期長達5～10 a(平均7 a)。因此，一次暴露，可在人體長期存在；長期暴露可導致其在體內(nèi)蓄積，導致嚴重損害。2,3,7,8-四氯二苯并對二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD)是二噁英中毒性最強的一種，也是目前在持久性有機污染物中研究最為廣泛也是最為深入的物質[1]。研究發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)是TCDD毒性最敏感的靶點之一[2]，TCDD是已知最有效的免疫抑制化學物質之一[3]。但是TCDD的免疫毒性機制尚不完全清楚，AhR通路是介導TCDD毒性的主要途徑[4]。TCDD的免疫毒性可能與TCDD誘導的免疫細胞失衡(Th細胞分化和成熟障礙，Treg細胞亞群減少等)[5]、表觀遺傳學改變(DNA甲基化、AhR依賴性組蛋白修飾等)等有關[6]。

運動也可以對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生深遠的影響，運動對免疫參數(shù)的影響取決于運動強度，在高水平運動中，則取決于訓練的持續(xù)時間和負荷[7]。雖然高強度的運動是否獨立于其他因素而抑制免疫功能尚存爭議，但定期進行中到大強度的運動有益于提升免疫功能。研究表明，規(guī)律的運動可以降低傳染性疾病(如細菌和病毒感染)和非傳染性疾病(如癌癥和慢性炎癥性疾病)的發(fā)病率，提高免疫能力[8-10]，還能延緩免疫衰老的發(fā)生[11]。這可能與運動降低系統(tǒng)性炎癥水平、提升免疫調(diào)節(jié)能力以及改善免疫細胞代謝等有關。

多數(shù)研究僅針對單種因素對免疫功能的影響，而現(xiàn)實中免疫功能受多種因素的綜合影響，因此，通過動物模型試驗探究TCDD和運動對免疫功能的交互影響具有一定的意義。

Th1和Th2細胞均是輔助型T細胞的亞群。Th1/Th2平衡是機體細胞免疫與體液免疫平衡的標志，Th1和Th2型細胞因子分泌的改變是Th1/Th2平衡常用的評價依據(jù)[12]。Th1細胞分泌干擾素-γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子(TNF)等細胞因子，主要介導細胞免疫應答，在抗胞內(nèi)病原體感染中發(fā)揮重要作用；Th2細胞分泌白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-5(IL-5)、白細胞介素-10(IL-10)和白細胞介素-13(IL-13)等細胞因子，與B細胞增殖、分化和成熟及抗體的生成有關，主要增強體液免疫[12-13]。白細胞介素-12(IL-12)是刺激Th1分化和分泌功能主要細胞因子。正常情況下，Th1和Th2細胞分泌的細胞因子促進自身增殖的同時抑制對方的增殖，因此Th1和Th2處于動態(tài)平衡中，一旦Th1細胞和Th2細胞之間的平衡狀態(tài)被打破，很可能造成人體細胞因子網(wǎng)絡的動態(tài)平衡被破壞，與許多疾病如1型糖尿病、過敏、哮喘和癌癥的產(chǎn)生和發(fā)展有關[12]。環(huán)境因素、壓力、運動和某些營養(yǎng)物質等因素均是改變Th1/Th2平衡的因素。

研究發(fā)現(xiàn)，TCDD可通過激活AhR影響免疫功能，使Th1/Th2向Th2極化[14]。運動改變Th1/Th2平衡可能與運動強度有關，劇烈運動使Th1/Th2向Th2極化而抑制免疫[15-18]；中等強度運動使Th1/Th2向Th1極化而增強免疫[19-22]；低強度自愿轉輪運動不足以影響Th1/Th2平衡[23]。但是尚未發(fā)現(xiàn)TCDD與運動對Th1/Th2平衡交互影響的研究。本研究以Th1/Th2平衡為切入點，研究TCDD與運動對免疫健康的交互影響，從而有助于理解運動與環(huán)境污染物對機體健康的交互影響，指導科學健身實踐。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗對象及分組

28只8周齡SPF級雄性Wistar大鼠(購自北京維通利華實驗動物中心，許可證號SCXK(京)2006-00098)，體重(338.32±16.74) g，進行適應性飼養(yǎng)1周。隨后將大鼠隨機分成4組：正常對照組(Normal Control, NC)、TCDD對照組(Toxic Control, TC)、運動對照組(Exercise Control, EC)、TCDD運動組(Exercise Toxic, ET)，每組7只。各組大鼠分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度22.75 ℃±1.33 ℃，濕度50.57%±7.53%，晝夜交替時間12 h，提供國家標準嚙齒類動物飼養(yǎng)飼料，自由飲食、飲水。本研究已經(jīng)通過了清華大學動物福利倫理委員會審批。

1.2 TCDD暴露及運動方案

將TCDD(購自美國Cambridge Isotope Laboratories Inc，純度99%)溶于玉米油中，TC組和ET組大鼠以10 μg·kg-1體重的劑量腹腔注射TCDD，NC組和EC組大鼠腹腔注射等量玉米油。

EC組和ET組大鼠尾部負重5%(尾根套負重螺絲)進行游泳，每天游30 min，每周游6 d，持續(xù)4周，每天游泳時間固定，根據(jù)每周稱重調(diào)整負重。游泳水桶直徑150 cm，水深75 cm，水溫為32 ℃±2 ℃。NC組與TC組大鼠靜養(yǎng)。

1.3 實驗取材

所有大鼠均在運動組大鼠最后一次運動結束48 h后進行取材。取材前禁食8 h，稱重并記錄。用20%(w/v)的烏拉坦，按照2 g·kg-1體重的劑量，腹腔注射麻醉。打開大鼠腹腔，腹主動脈取血，離心后分離血清，-20 ℃凍存?zhèn)溆??？焖俜蛛x大鼠胸腺和脾，生理鹽水浸洗，濾紙吸干，稱重并記錄，計算胸腺相對重量=胸腺重量/體重，脾相對重量=脾重量/體重。

1.4 血清指標測試

采用Elisa法測定大鼠血清細胞因子：TNF-α、IFN-γ、IL-12和IL-13濃度，并計算IFN-γ/IL-13和IL-12/IL-13比值。試劑盒購自美國Rapidbio公司，嚴格按照說明書進行操作。用英國Biochrom公司Anthos2010型酶標儀讀取吸光度，計算細胞因子濃度。

1.5 統(tǒng)計分析

2 結果(Results)

2.1 運動對TCDD暴露大鼠胸腺和脾相對重量的影響

TCDD暴露對胸腺相對重量(F=24.373，P=0.000，偏Eta方=0.504)有主效應，可明顯減小胸腺相對重量。運動對胸腺相對重量(F=2.769，P=0.109，偏Eta方=0.103)無主效應。運動和TCDD暴露對胸腺相對重量(F=0.065，P=0.801，偏Eta方=0.003)無交互主效應。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，TC組大鼠胸腺相對重量明顯減小(P<0.01)；與EC組相比，ET組大鼠胸腺相對重量明顯減小(P<0.01)，結果如圖1所示。

圖1 運動對2,3,7,8-四氯二苯并對二噁英(TCDD) 暴露大鼠胸腺相對重量的影響注：NC表示正常對照組，EC表示運動對照組，TC表示TCDD 對照組，ET表示TCDD運動組；第1個字母代表相同暴露 條件下不同運動干預的差異，第2個字母代表相同運動 干預條件下不同暴露的差異，不同的字母代表P<0.05。Fig. 1 The effect of exercise on the relative weight of thymus of rats exposed to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD)Note: NC stands for normal control group; EC stands for exercise control group; TC stands for toxic control; ET stands for exercise toxic group; the first letter represents the difference between different exercise interventions under the same exposure condition, and the second letter represents the difference between different exposures under the same exercise intervention; different letters indicate significant differences at P<0.05.

TCDD暴露對脾相對重量(F=7.328，P=0.012，偏Eta方=0.234)有主效應，可明顯增大脾臟相對重量。運動對脾相對重量(F=0.874，P=0.359，偏Eta方=0.035)無主效應。運動和TCDD暴露對脾相對重量(F=0.000，P=0.999，偏Eta方=0.000)無交互主效應。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，TC組大鼠脾相對重量有增大的趨勢(P=0.067)；與EC組相比，ET組大鼠脾相對重量有增大的趨勢(P=0.068)，結果如圖2所示。

圖2 運動對TCDD暴露大鼠脾相對重量的影響Fig. 2 The effect of exercise on the relative weight of spleen of rats exposed to TCDD

2.2 運動對TCDD暴露大鼠血清細胞因子的影響

TCDD暴露對血清TNF-α(F=9.180，P=0.006，偏Eta方=0.277)有主效應，可明顯降低血清TNF-α濃度。運動對血清TNF-α(F=0.336，P=0.567，偏Eta方=0.014)濃度無主效應。運動和TCDD暴露對血清TNF-α(F=0.010，P=0.920，偏Eta方=0.000)濃度均無交互效應。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，TC組血清TNF-α濃度明顯降低；與EC組相比，ET組血清TNF-α濃度明顯降低，結果如圖3所示。

圖3 運動對TCDD暴露大鼠血清腫瘤 壞死因子-α(TNF-α)濃度的影響注：第1個字母代表相同暴露條件下不同運動干預的差異，第2個字母 代表相同運動干預條件下不同暴露的差異，不同的字母代表P<0.05。Fig. 3 The effect of exercise on the serum tumor necrosis factor-α (TNF-α) concentration of rats exposed to TCDDNote: The first letter represents the difference between different exercise interventions under the same exposure condition, and the second letter represents the difference between different exposures under the same exercise intervention; different letters indicate significant differences at P<0.05.

TCDD暴露對血清IFN-γ(F=0.187，P=0.669，偏Eta方=0.008)濃度無主效應。運動對血清IFN-γ(F=0.195，P=0.663，偏Eta方=0.0080)濃度無主效應。運動和TCDD暴露對血清IFN-γ(F=0.668，P=0.422，偏Eta方=0.027)濃度無交互效應，結果如圖4所示。

圖4 運動對TCDD暴露大鼠 血清干擾素-γ(IFN-γ)濃度的影響Fig. 4 The effect of exercise on the serum interferon-γ (IFN-γ) concentration of rats exposed to TCDD

TCDD暴露對血清IL-12(F=9.702，P=0.005，偏Eta方=0.288)濃度有主效應，可明顯降低血清IL-12濃度。運動對血清IL-12(F=0.195，P=0.663，偏Eta方=0.0080)濃度無主效應。運動和TCDD暴露對血清IL-12(F=0.668，P=0.422，偏Eta方=0.027)濃度無交互效應。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，TC組血清IL-12濃度明顯降低，結果如圖5所示。

圖5 運動對TCDD暴露大鼠血清白細胞 介素-12(IL-12)濃度的影響注：第1個字母代表相同暴露條件下不同運動干預的差異，第2個字母 代表相同運動干預條件下不同暴露的差異，不同的字母代表P<0.05。Fig. 5 The effect of exercise on the serum interleukin-12 (IL-12) concentration of rats exposed to TCDDNote: The first letter represents the difference between different exercise interventions under the same exposure condition, and the second letter represents the difference between different exposures under the same exercise intervention; different letters indicate significant differences at P<0.05.

運動對TCDD暴露大鼠血清Th2相關細胞因子IL-13的影響如圖6所示。TCDD暴露對血清IL-13(F=2.736，P=0.111，偏Eta方=0.102)濃度無主效應。運動對血清IL-13(F=0.322，P=0.575，偏Eta方=0.013)濃度無主效應。運動和TCDD暴露對血清IL-13濃度(F=8.201，P=0.009，偏Eta方=0.255)有交互效應。無運動時，TCDD暴露對血清IL-13濃度無明顯影響，有運動時TCDD暴露明顯降低血清IL-13濃度；無TCDD暴露時運動明顯升高血清IL-13濃度，有TCDD暴露時運動對血清IL-13濃度無明顯影響。

圖6 運動對TCDD暴露大鼠血清白細胞 介素-13(IL-13)濃度的影響注：第1個字母代表相同暴露條件下不同運動干預的差異，第2個字母 代表相同運動干預條件下不同暴露的差異，不同的字母代表P<0.05。Fig. 6 The effect of exercise on the serum (IL-13) concentration of rats exposed to TCDDNote: The first letter represents the difference between different exercise interventions under the same exposure condition, and the second letter represents the difference between different exposures under the same exercise intervention; different letters indicate significant differences at P<0.05.

TCDD暴露對IFN-γ/IL-13比值(F=1.354，P=0.256，偏Eta方=0.053)無主效應。運動對IFN-γ/IL-13比值(F=0.014，P=0.908，偏Eta方=0.001)無主效應。運動和TCDD暴露對IFN-γ/IL-13比值(F=4.157，P=0.053，偏Eta方=0.148)無交互效應。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與EC組相比，ET組IFN-γ/IL-13比值明顯升高，結果如圖7所示。

圖7 運動對TCDD暴露大鼠血清細胞 因子(IFN-γ/IL-13)的影響注：第1個字母代表相同暴露條件下不同運動 干預的差異，第2個字母代表相同運動干預條件下不同 暴露的差異，不同的字母代表P<0.05。Fig. 7 The effect of exercise on the IFN-γ/IL-13 ratio of rats exposed to TCDDNote: The first letter represents the difference between different exercise interventions under the same exposure condition, and the second letter represents the difference between different exposures under the same exercise intervention; different letters indicate significant differences at P<0.05.

TCDD暴露對IL-12/IL-13比值(F=2.944，P=0.099，偏Eta方=0.109)無主效應。運動對IL-12/IL-13比值(F=0.002，P=0.969，偏Eta方=0.000)無主效應。運動和TCDD暴露對IL-12/IL-13比值(F=15.262，P=0.001，偏Eta方=0.389)有交互效應。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，TC組和EC組IL-12/IL-13比值明顯降低，與TC組相比，ET組IL-12/IL-13比值明顯升高，結果如圖8所示。

圖8 運動對TCDD暴露大鼠血清細胞 因子(IL-12/IL-13)的影響注：第1個字母代表相同暴露條件下不同運動干預的差異，第2個字母 代表相同運動干預條件下不同暴露的差異，不同的字母代表P<0.05。Fig. 8 The effect of exercise on the IL-12/IL-13 ratio of rats exposed to TCDDNote: The first letter represents the difference between different exercise interventions under the same exposure condition, and the second letter represents the difference between different exposures under the same exercise intervention; different letters indicate significant differences at P<0.05.

3 討論(Discussion)

3.1 運動對TCDD暴露大鼠胸腺相對重量的影響

幾乎在所有的被研究過的物種中，TCDD暴露均以依賴AhR的方式導致免疫抑制和胸腺萎縮，但其確切的細胞和分子機制在很大程度上仍是未知的[24-27]。本研究也發(fā)現(xiàn)，急性TCDD暴露(10 μg·kg-1)明顯減小了大鼠胸腺相對重量，導致胸腺萎縮，說明TCDD暴露抑制了免疫功能。研究發(fā)現(xiàn)，中等強度運動沒有明顯改變胸腺重量[28-29]，但是劇烈運動或力竭性運動會導致胸腺萎縮[30-32]。本研究采用負重5%的游泳運動，屬于中等強度運動。運動對胸腺相對重量沒有主效應，說明4周游泳運動也沒有改變胸腺相對重量，這與之前的研究結果一致。運動與TCDD暴露對胸腺相對重量沒有交互效應，說明4周游泳運動也不能明顯改善TCDD暴露導致的胸腺萎縮。

3.2 運動對TCDD暴露大鼠脾相對重量的影響

目前，關于TCDD暴露對脾相對重量影響的研究結果不一致：TCDD暴露(0.09 μg·kg-1·d-1，28 d)小鼠脾絕對重量和相對重量沒有明顯變化[33]；TCDD暴露(2.5 μg·kg-1，24周)導致小鼠脾腫大，可能與TCDD暴露誘導AKT活化和DNA損傷破壞了脾細胞的生長調(diào)節(jié)有關[34]；急性TCDD暴露(50 μg·kg-1)以AhR依賴的方式導致小鼠脾萎縮[35]；圍產(chǎn)期TCDD暴露導致子代小鼠脾絕對重量和相對重量下降[36]，說明暴露劑量和方式可能是導致結果差異的關鍵因素。本研究發(fā)現(xiàn)，急性TCDD暴露(10 μg·kg-1)4周后大鼠脾相對重量明顯增大。研究發(fā)現(xiàn)，劇烈運動或力竭性運動導致脾相對重量減小[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)，運動對脾相對重量沒有主效應，說明5%負重的游泳運動(中等強度)沒有改變脾相對重量。運動與TCDD暴露沒有交互效應，說明4周游泳運動不能明顯改善TCDD暴露所致的脾腫大。

3.3 運動對TCDD暴露大鼠血清Th1/Th2相關細胞因子的影響

之前的研究發(fā)現(xiàn)，TCDD可通過激活AhR，使Th1/Th2平衡向Th2極化，而抑制免疫功能[14,37]。本研究發(fā)現(xiàn)，急性TCDD暴露(10 μg·kg-1)4周后，血清中Th1相關細胞因子TNF-α和IL-12濃度下降，IFN-γ濃度沒有明顯變化；血清中Th2細胞因子IL-13濃度沒有明顯變化；IL-12/IL-13明顯減小，說明Th2相關細胞因子相對增加，Th1/Th2向Th2極化。IL-12具有促進Th1分化和分泌細胞因子INF-γ和TNF-α的功能以及抑制Th2分化的功能[12]。在本研究中TCDD暴露導致血清IL-12濃度下降，這可能導致TNF-α分泌減少的同時，也導致對Th2的抑制減少，使IL-13分泌增加不顯著。因此，TCDD使Th1/Th2向Th2極化，抑制大鼠的免疫功能。Th1/Th2向Th2極化可能增加感染的易感性[13]。

研究發(fā)現(xiàn)，劇烈運動使Th1/Th2向Th2極化而抑制免疫[15-18]；中等強度運動使Th1/Th2向Th1極化而增強免疫[19-22]；自愿轉輪運動不足以影響Th1/Th2平衡[23]，這說明，運動改變Th1/Th2平衡可能與運動強度有關，適宜運動才能促進機體免疫健康。因此，本研究選擇中等強度運動作為干預手段。運動對血清中Th1/Th2相關的4種細胞因子濃度以及對標示Th1/Th2極化的IFN-γ/IL-13和IL-12/IL-13比值均沒有主效應，提示4周游泳運動并不會導致Th1/Th2極化。這與之前的研究得出的中等強度運動使Th1/Th2向Th1極化的結果不一致，可能與實驗設計和統(tǒng)計方法不一致有關。有交互效應分析的雙因素方差分析能夠排除混雜因素導致的顯著性差異，本研究中TCDD暴露與否是運動效應的混雜因素。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，運動和TCDD暴露對血清IL-13濃度以及IL-12/IL-13比值有交互效應，說明雖然急性TCDD暴露后運動沒有明顯改變血清中Th1相關的細胞因子IFN-γ和IL-12的濃度，但是明顯降低了血清中Th2相關的細胞因子IL-13的濃度，從而明顯升高了IL-12/IL-13比值，說明急性TCDD暴露后運動使Th1/Th2向Th1方向極化，改善了TCDD暴露大鼠的免疫水平。

綜上所述，急性TCDD暴露使大鼠胸腺萎縮，脾腫脹，Th1/Th2相關細胞因子向Th2極化，破壞Th1/Th2相關細胞因子平衡而抑制免疫功能。4周游泳運動雖然不能明顯減輕TCDD暴露所致的胸腺萎縮和脾腫脹，但能夠在一定程度上減輕TCDD暴露所致的Th1/Th2相關細胞因子失衡而改善免疫功能。