肖學宸 ，王培育 ，葉 煒 ，陳 燕 ，蘇立遙 ，許旭明 ，賴鐘雄 ，林玉玲 *

（1.福建農(nóng)林大學園藝植物生物工程研究所，福建福州 350002；2.三明農(nóng)業(yè)科學研究院，福建沙縣 365000）

褪黑素（N-乙?；?5-甲氧基色胺）是在植物和動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種重要的吲哚胺激素[1]。大量的研究證明了褪黑素增強人體免疫系統(tǒng)和抵抗癌癥的能力[2-5]。迄今為止，研究人員在番茄[6]、辣椒[7]、甜櫻桃[8]和桑葉[9]等植物中均檢測出褪黑素的存在。Galano 等[10]發(fā)現(xiàn)褪黑素可以滲透到任何植物組織，并作為抗氧化劑清除組織中的活性氧和活性氮。Debnath 等[11]發(fā)現(xiàn)褪黑素也是一種化學傳遞信號，通過提高其他抗氧化劑效率的方式，在植物受到脅迫時為正常的植物生長提供保護。同時，外源褪黑素的施加通過影響糖尿素-蘿卜硫素系統(tǒng)[12]、保護細胞膜完整性[13]、提高抗氧化物質(zhì)活性[14]和減輕褐變[15]等方式，對食品的采后保鮮產(chǎn)生一定的積極作用，這意味著褪黑素在植物代謝過程中扮演著重要角色。

藥用石斛是兼具觀花功能的藥草，它的不同種和品種在全球各地的鮮花市場中占據(jù)了超過20%的銷售份額[16]。在傳統(tǒng)中藥中，藥用石斛是免疫力增強劑[17]，還具有降低血糖[18]和保護肝臟[19]的作用。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，金釵石斛、鼓槌石斛和霍山石斛的多糖和菲類化合物提取物具有抗癌作用[17，20]。羅傲霜等[21]和張勇等[22]發(fā)現(xiàn)迭鞘石斛和鐵皮石斛也具有提高免疫力和抗癌的作用。Liu 等[23]的最新研究同樣表明了藥用石斛具有改善動物免疫力的作用。同時，Moretti 等[24]將藥用石斛抵抗衰老的功效歸因于它具有抗氧化的特性。因此，褪黑素在藥用石斛中可能存在并在藥用石斛的藥效中發(fā)揮了直接或間接的作用。Lim 等[25]發(fā)現(xiàn)外源褪黑素會導致石斛原球莖中出現(xiàn)不規(guī)則的細胞譜系，但截至目前，藥用石斛的內(nèi)源褪黑素動態(tài)水平變化還未見報道。

因此，該研究擬借助8 種具有高藥效的藥用石斛，探討種、植株年齡、組織成熟度、植株部位和晝夜變化對藥用石斛內(nèi)源褪黑素含量的影響，以期為藥用石斛中有效成分的進一步開發(fā)和研究褪黑素的作用機理提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料。試驗選擇不同年齡且具有高藥用價值的流蘇石斛（Dendrobium fimbriatumHook，V1）、迭鞘石斛（Dendrobium denneanumKerr，V2）、紫皮石斛（Dendrobium devoninumPaxt，V3）、金釵石斛（Dendrobium nobileLindl，V4）、鼓槌石斛（Dendrobium chrysotoxumLindl，V5）、劍葉石斛 （Dendrobium acinaciformeRoxb，V6）、鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo，V7） 和霍山石斛（Dendrobium huoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng，V8），表型如圖1 所示。

1.1.2 試驗試劑。ELISA 檢測試劑；磷酸緩沖液（購于上海江萊公司）。

1.1.3 試驗條件。8 種藥用石斛都在大棚中具有相同比例的干燥椰子殼基質(zhì)的塑料盆中正常生長，外觀如圖1所示。根據(jù)不同種的特性，每個盆中的藥用石斛數(shù)量為5~20。1 周澆水2 次，采摘過程中溫室溫度在8℃~28℃之間，溫室中的濕度為60%~80%。采摘之后的試驗在三明農(nóng)業(yè)科學研究院的實驗室進行，使用的儀器在2 年內(nèi)購買且沒有損壞，實驗室溫度保持在25℃。

圖1 流蘇石斛（V1）、迭鞘石斛（V2）、紫皮石斛（V3）、金釵石斛（V4）、鼓槌石斛（V5）、劍葉石斛（V6）、鐵皮石斛（V7）和霍山石斛（V8）的表型

1.2 方法

1.2.1 樣品采集。樣品采摘時間為2020 年1 月1—3 日，采摘后立即用液氮冷凍并于-60℃保存。為了確保樣品的代表性，每盆石斛中僅選擇一株生長適中且無病害的植株，3 株為一組，將測定的相同組織部位切碎并混合均勻，進行褪黑素的提取。設置3 次生物學重復，分別提取，提取后立即進行褪黑素含量檢測。

1.2.2 褪黑素含量測定。使用植物褪黑素ELISA 檢測試劑盒（上海江萊公司）檢測藥用石斛的褪黑素含量。根據(jù)具體情況，按說明書比例增加了稱取的樣品質(zhì)量和磷酸鹽緩沖溶液。

（1）提?。悍Q取切碎混勻的植株部位0.2 g，添加1.8 mL預冷的磷酸鹽緩沖溶液，在冰浴條件下將其研磨成勻漿。離心（5 000 g，8 min）得到勻漿并收集上清液。3 次生物學重復得到的上清液混合。

（2）測定：在96 孔酶標板的孔中加入50 μL 提取得到的上清液或標準濃度的褪黑素溶液（空白對照為添加50 μL 樣品稀釋液）。加入100 μL 辣根過氧化物酶溶液，在用膜密封孔的條件下于37℃孵育1 h。取出酶標板，棄去孔中的液體，加入20 倍稀釋的洗滌溶液，靜置1 min。棄去液體后，在吸水紙上輕輕拍打酶標板。再次添加洗滌液進行洗滌，總共重復洗滌步驟5 次。清洗后，依次加入TMB 底物溶液A 和B 50 μL，并立即在37℃的條件下黑暗孵育15 min。最后取出酶標板，添加50 μL 終止溶液終止反應，并用酶標儀測量樣品的吸收光密度（波長450 nm），通過與標準曲線（圖2）比較，最終獲得褪黑素的濃度。設技術重復3 次。

圖2 褪黑素濃度和吸光度標準曲線

1.2.3 數(shù)據(jù)分析。褪黑素濃度表示為平均值±SD，并且通過Duncan’s 檢驗，檢測測定值是否存在統(tǒng)計學顯著差異（0.05 為顯著性水平）。統(tǒng)計分析在SPSS 軟件上進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 種間因素對褪黑素含量的影響分析

為探究種間因素對褪黑素含量的影響，以8 種主要藥用石斛一年生成熟莖（P4）為原材料，其褪黑素含量在27.19~89.81 pg/g 區(qū)間波動（圖3）。褪黑素含量最低的是鐵皮石斛（V7，27.19±5.81 pg/g，f.w.），最高是金釵石斛（V4，89.81±1.60 pg/g，f.w.），金釵石斛（V4）的褪黑素含量比鐵皮石斛（V7）高 230%。同時，Duncan’s 檢驗將 8 種藥用石斛一年生成熟莖（P4）的褪黑素含量分成了5 個差異顯著的子集并呈現(xiàn)出階梯狀（P≤0.05）。這說明種間差異是影響藥用石斛褪黑素含量的重要因素。

圖3 不同種藥用石斛一年生成熟莖（P4）的褪黑素含量

2.2 藥用石斛褪黑素含量的晝夜變化分析

為探究藥用石斛褪黑素含量的晝夜變化，選擇多種藥用石斛不同部位測定褪黑素含量。在迭鞘石斛（V2）中，一年生頂葉的褪黑素含量隨著時間的變化呈現(xiàn)階段性變化，且在相鄰時間點之間呈現(xiàn)明顯的升高和降低趨勢，最低點為：11：00 am（40.66±0.85 pg/g，f.w.），然后逐漸上升并達到最高點：11：00 pm（48.70±0.36 pg/g，f.w.），之后呈下降趨勢（圖5）。這表明黑暗可能會誘導褪黑素合成，或間接影響褪黑素含量。

圖4 迭鞘石斛（V2）一年生頂葉（P1）褪黑素含量的日變化

圖5 鐵皮石斛（V7）一年生頂葉（P1）11：00 am 至 11：00 pm的褪黑素含量變化

在鐵皮石斛 （V7） 的一年生頂葉 （P1，49.04±1.79-52.20±1.70 pg/g，f.w.）中出現(xiàn)了相同的褪黑素含量晝低夜高的現(xiàn)象（圖6）。同樣，在流蘇石斛（V1）中，一年生頂葉（P1，55.12±0.48-58.40±0.58 pg/g，f.w.）和一年生成熟莖（P4，53.13±0.28-54.49±0.59 pg/g，f.w.）的褪黑素含量隨著夜晚的到來顯著增加 （P≤0.05）；一年生成熟葉（P3）和二年生成熟莖（P6）的褪黑素含量雖然有增加但并不顯著（P>0.05）（圖7）。初步分析，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能和褪黑素的功能有關。

圖6 流蘇石斛（V1）不同部位于11：00 am 和11：00 pm的褪黑素含量對比

3 討論

3.1 種間差異是影響藥用石斛褪黑素含量的最主要因素

褪黑素在藥用石斛各組織部位的廣泛存在表明它可能在藥用石斛的藥效中扮演著重要的角色。研究人員在測定櫻桃[26]、番茄[6]、桑葉[9]、草莓[27]和辣椒[7]的褪黑素含量時，將種視為影響褪黑素含量的最主要因素。相較于蘋果（47.6 pg/g）[28]，櫻桃（12.4 pg/g）[26]，土豆（10 pg/g）[27]和香蕉（1.6 pg/g）[27]等果蔬，藥用石斛的褪黑素含量處于較高水平。但是，紅番茄（0.64~14.77 ng/g）[7]，黑芥菜籽（129 ng/g）[29]和桑葉（1 510 ng/g）[30]等果蔬的褪黑素含量高于藥用石斛。與其他物種相比，藥用石斛的褪黑素含量并不處于很高水平，但依然超過了許多日常食用的果蔬，同時，這表明褪黑素可能在藥用石斛的抵抗衰老、提高免疫力和抗癌功效中起更多間接作用，如Debnath 等[11]所述，褪黑素可以通過增加其他抗氧化劑的活性來發(fā)揮作用。在上述一些報告中，有研究分析稱測量方法也是影響樣品中褪黑素含量的一個重要因素。但總而言之，在相同測定方法的條件下，檢測出不同種藥用石斛之間的褪黑素含量存在巨大差異，這表明種可作為選擇高褪黑素含量的藥用石斛的一個標準。

3.2 藥用石斛褪黑素含量的規(guī)律性波動可能為晝低夜高

Zhao 等[8]在甜櫻桃果實中觀測到了褪黑素含量在夜間升高的現(xiàn)象，此現(xiàn)象說明了光是內(nèi)源褪黑素含量的影響因素之一，黑暗可能能誘導褪黑素的合成。Morteza Soleimani Aghdam 等[13]證明褪黑素可以促進內(nèi)源性多胺、一氧化氮和脯氨酸的積累，從而提高番茄的耐寒性。在這項試驗中，3 種藥用石斛的褪黑素含量出現(xiàn)了相同的晝低夜高現(xiàn)象，除了光因素的影響，晝夜溫差也可能是造成此現(xiàn)象的原因。

在石斛中，年幼組織生長發(fā)育和莖上開花需要消耗和積累大量的能量物質(zhì)[31-32]。能量物質(zhì)的高消耗水平意味著高強度的呼吸作用。Zhao 等[8]的研究表明，氧化應激誘導褪黑素合成。同時，最近的一項報道顯示，褪黑素可以作為一種有效的抗氧化劑提高鮮切花西蘭花中的葡萄糖尿素和蘿卜硫素含量[12]。褪黑素還可以在降低采后櫻桃的H2O2含量方面發(fā)揮積極作用[14]。在收獲時期，頂葉的生長和莖的開花過程都處于進行狀態(tài)，在沒有光合作用的情況下，處于代謝較旺盛時期的一年生頂葉和成熟莖在夜間進行較高水平的能量代謝后，提升更高的褪黑素含量可能有助于清除氧化性自由基。