劉冬冬，何紹平，姜亞運(yùn)，袁成良

(德陽市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,四川 德陽 618000)

2020年，一種新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)被發(fā)現(xiàn)，研究顯示存在人傳人現(xiàn)象[1-2]。病毒基因測序后，與核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(GenBank)比對，發(fā)現(xiàn)其與非典(SARS) 病毒相似[3]。新型冠狀病毒感染席卷全球，在許多國家暴發(fā)流行，隨著各地病例數(shù)的增多，部分地區(qū)報(bào)道了無癥狀感染者的存在[4]。無癥狀感染者的存在可導(dǎo)致疑似感染者及密切接觸者數(shù)量大量增加，加速疫情的蔓延。相比病毒測序，實(shí)時(shí)熒光PCR試劑研發(fā)和生產(chǎn)速度較快[5]，操作簡單、耗時(shí)短、成本低[6]，所以實(shí)時(shí)熒光PCR檢測新型冠狀病毒核酸成為確診COVID-19的主要方法。自中國疾控中心公布新型冠狀病毒基因序列后，許多公司迅速推出新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒。但目前僅有少量文獻(xiàn)對新型冠狀病毒核酸檢測試劑進(jìn)行評價(jià)[7-9]。

本研究以已獲得中國疾控中心批準(zhǔn)上市的上海之江生物技術(shù)有限公司的新型冠狀病毒核酸檢測試劑作為比對試劑，檢測了14例COVID-19確診患者，以及211例普通入院患者咽拭子樣本中的新型冠狀病毒核酸，對不同試劑的新型冠狀病毒核酸陽性檢出率及Ct值進(jìn)行了對比觀察，評價(jià)邁克生物股份有限公司的同類試劑的檢測性能，為臨床及檢測部門選取合適的檢測試劑提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來源 14例咽拭子陽性標(biāo)本來源于四川省疾控中心確診的COVID-19患者，211例咽拭子陰性標(biāo)本來源于2020年2月18日至2月24日211例普通入院篩查患者。

1.2檢測試劑與儀器 新型冠狀病毒核酸檢測試劑：試劑A(上海之江生物科技股份有限公司，批號(hào)P20200209，國械注準(zhǔn)20203400057)，試劑B(邁克生物股份有限公司，批號(hào)020041，國械注準(zhǔn)20203400184)。兩種試劑的基本信息見表1。

表1 兩種核酸檢測試劑盒的基本信息

1.3檢測方法 在生物安全柜內(nèi)，打開標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)箱，取出待檢標(biāo)本。將咽拭子采樣管充分振蕩混勻后靜置10 min，取上清液1 mL 轉(zhuǎn)移至2 mL 螺口管中。采用上海之江生物科技有限公司生產(chǎn)的病毒DNA/RNA提取試劑盒(批號(hào):20200201)和EX3600全自動(dòng)核酸提取儀提取咽拭子的RNA，具體操作參照試劑盒說明書。參照各試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)體系配制、反應(yīng)參數(shù)和程序的設(shè)置。采用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果以Ct值表示。

2 結(jié) 果

2.1兩種試劑檢測的新型冠狀病毒ORF1ab基因、N基因、E基因的Ct值比較 兩種試劑對14例標(biāo)本的各基因檢測Ct值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。兩種檢測試劑結(jié)果判讀對14例COVID-19確診患者標(biāo)本判讀均為陽性，211例普通入院患者判讀為210例陰性，1例無效，重復(fù)實(shí)驗(yàn)后判讀為陰性，考慮是操作的偶然誤差。

表2 兩種核酸檢測試劑盒的檢測結(jié)果比較

2.2兩種試劑檢測的新型冠狀病毒 ORF1ab基因、N基因、E基因的相關(guān)性分析 為進(jìn)一步探究兩種試劑檢測結(jié)果的一致性，將邁克和之江的新型冠狀病毒檢測結(jié)果作散點(diǎn)圖，并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，兩種試劑檢測新型冠狀病毒中的ORF1ab基因、N基因、E基因的相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.824、0.834和0.890，均P<0.01，見圖1。由此，我們認(rèn)為邁克與之江的新型冠狀病毒核酸檢測試劑檢測結(jié)果一致性良好。

A.ORF1ab基因；B.N基因；C.E基因。

2.3參考比對試劑，邁克檢測結(jié)果的相對偏差分析 參考之江新型冠狀病毒核酸檢測結(jié)果，邁克的ORF1ab基因、N基因的相對偏差均在±16%以內(nèi)，且均在評價(jià)范圍的標(biāo)準(zhǔn)之內(nèi)，見表3。內(nèi)參基因的相對偏差略大，可能是兩種試劑盒所檢測的基因片段存在差異。

表3 兩種核酸檢測試劑盒的檢測結(jié)果

3 討 論

目前，國外感染人數(shù)仍不斷增加，全球疫情仍十分嚴(yán)峻。國家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布了《關(guān)于加快推進(jìn)冠病毒核酸檢測的實(shí)施意見》，提出積極擴(kuò)大新型冠狀病毒核酸檢測范圍，全力排查風(fēng)險(xiǎn)隱患，要求重點(diǎn)人群“應(yīng)檢盡檢”，其他人群“愿檢盡檢”。因此，國內(nèi)外對核酸檢測試劑需求量日益增加。COVID-19診斷較為復(fù)雜，需結(jié)合流行病史、臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果綜合判斷[10]。根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測新型冠狀病毒核酸陽性為確診病例的病原學(xué)“金標(biāo)準(zhǔn)”之一[11]。

2020年1月，我國科研工作人員通過基因組測序成功破譯新型冠狀病毒全基因組序列，并提交在GenBank和virologic.org網(wǎng)站。隨后，各種新型冠狀病毒檢測試劑盒相繼面世，因PCR方法有著靈敏度高、特異性強(qiáng)和易操作的優(yōu)點(diǎn)[12]，目前已成為檢測新型冠狀病毒核酸的主要方法[13]。加之臨床診療工作需要檢測得及時(shí)和準(zhǔn)確，無癥狀感染者需早發(fā)現(xiàn)、早隔離，實(shí)時(shí)熒光PCR的核酸檢測仍是其主要的確診方法。但新型冠狀病毒核酸檢出率只有30%～50%[14]，除去檢測樣本的影響，檢測試劑盒未經(jīng)過大量臨床樣本優(yōu)化也是一個(gè)重要因素[15]。所以，新型冠狀病毒核酸檢測試劑經(jīng)過完整的性能驗(yàn)證及臨床試驗(yàn)驗(yàn)證，對減少結(jié)果假陰性或假陽性十分重要。

本研究中，以我國法定檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)檢定合格的首個(gè)新型冠狀病毒檢測產(chǎn)品，且已獲得中國疾控中心國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的上海之江生物技術(shù)有限公司的新型冠狀病毒核酸檢測試劑作為比對試劑，與邁克生物技術(shù)有限公司的新型冠狀病毒核酸檢測試劑進(jìn)行比較。采用盲法平行測定，數(shù)據(jù)顯示陽性檢出率和陰性符合率一致性，ORF1ab基因、N基因和E基因的檢測相關(guān)性較強(qiáng)，檢測相對偏差均在可接受范圍內(nèi)。綜上所述，與已獲批上市的試劑比對，邁克生物技術(shù)有限公司的新型冠狀病毒核酸檢測試劑可滿足臨床需求，具有臨床適用性。