劉盛祥，黃宇鵬，楊國康，金紅艷

心肌肥厚是心肌細(xì)胞為克服增高的壓力負(fù)荷，保證心臟充足射血量的一種代償性反應(yīng)，長期、嚴(yán)重的心肌肥厚引起心肌結(jié)構(gòu)及功能的失代償，最終導(dǎo)致心律失常、心力衰竭及猝死等不良心血管事件的發(fā)生[1]。小檗堿是一種從植物中提取的異喹啉類生物堿，具有一定的抗心肌肥厚作用，但其在心肌肥厚中的具體分子機(jī)制尚不明確[2]。微小RNA(micro RNA，miRNA)是內(nèi)源性小分子非編碼RNA，大量研究證實，miRNA在心肌肥厚中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[3-4]。本研究為證實小檗堿在抗心肌肥厚中的作用是否與miRNA相關(guān)，構(gòu)建壓力負(fù)荷誘導(dǎo)下的大鼠心肌肥厚模型，探討小檗堿對心肌肥厚的影響及其可能機(jī)制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗動物：SPF級健康雄性SD大鼠36只,8～10周齡,體質(zhì)量160～200 g,由武漢科技大學(xué)實驗動物中心提供,動物許可證為SYXK(新)2016-003、合格證為SCXK(新)2016-0002。(2)藥物及試劑：鹽酸小檗堿(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，一抗AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β及內(nèi)參GAPDH(北京科海瑞嘉生物科技有限公司)，BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)。(3)儀器設(shè)備：飛利浦HD11 XE超聲診斷儀(德國Philips公司)、移液槍(德國Eppendorf公司)、實時熒光定量PCR儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)、凝膠成像儀(美國Protein Simple公司)。

1.2 實驗方法 2019年6月—2020年9月于武漢科技大學(xué)實驗動物中心進(jìn)行實驗。心肌肥厚模型的構(gòu)建：SPF級雄性SD大鼠36只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組及小檗堿組，每組12只。模型制備方法參照文獻(xiàn)[5]，大鼠腹腔注射2.5%戊巴比妥麻醉，分離肌肉及組織，游離腹主動脈，模型組大鼠掛線結(jié)扎腹主動脈，超聲多普勒檢測腹主動脈達(dá)到70%狹窄視為造模成功；假手術(shù)組只暴露腹主動脈后關(guān)腹不做任何處理；小檗堿組大鼠在模型組基礎(chǔ)上予以小檗堿100 mg·kg-1·d-1灌胃處理，假手術(shù)組及模型組給予等劑量的生理鹽水灌胃處理。術(shù)后40 d用2.5%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后行心臟超聲檢測，完畢后立即取出心臟備用。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 心臟超聲指標(biāo)檢測：麻醉大鼠后使用高頻超聲診斷儀檢測各組大鼠的心臟指標(biāo)，包括左心室舒張末期后壁厚度(LVPWT)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

1.3.2 心體質(zhì)量比檢測：取出大鼠心臟后，清除心腔血液，預(yù)冷的生理鹽水清洗心腔，用濾紙吸干水分后，計算心體質(zhì)量比(心臟質(zhì)量/體質(zhì)量)。

1.3.3 心肌組織miR-21-3p、ANP、BNP基因表達(dá)：采用RT-qPCR方法檢測。以Trizol法從大鼠心肌組織中提取總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，取2 μl產(chǎn)物在熒光定量PCR儀器中擴(kuò)增?？偡磻?yīng)體系為20 μl，擴(kuò)增步驟如下：95℃預(yù)變性30 s、95 ℃變性5 s，60℃擴(kuò)增30 s，反復(fù)40個循環(huán)后進(jìn)行解離：95℃持續(xù)5 s、60℃持續(xù)60 s。心房鈉尿肽(ANP)、腦鈉肽(BNP)表達(dá)檢測以GAPDH為內(nèi)參，miR-21-3p表達(dá)檢測以U6為內(nèi)參，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3.4 心肌組織AKT、p-AKT、GSK3β和p-GSK3β蛋白表達(dá)檢測：用含有1%蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液裂解心肌組織，研磨勻漿后4 ℃下離心獲得全蛋白質(zhì)，每個樣品取等量的蛋白質(zhì)(20 μg)用10%凝膠進(jìn)行免疫印跡，然后將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉，加入相應(yīng)比例稀釋的一抗(目的基因AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β及內(nèi)參GAPDH稀釋比例均為1∶1 000)，在4℃搖床孵育過夜；次日用TBST將膜洗滌3次，并用對應(yīng)的二抗孵育1 h，用TBST洗滌3次后配制ECL發(fā)光反應(yīng)液，置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察蛋白的表達(dá)情況 。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠心臟超聲指標(biāo)比較 與假手術(shù)組比較，模型組 LVPWT增加(t/P=4.811/0.001)， LVEDD、LVEF減小(t/P=5.303/0.001、5.855/0.000)。與模型組比較，小檗堿組大鼠LVPWT減小(t/P=2.864/0.021)，LVEDD、LVEF增加(t/P=4.518/0.002、2.841/0.022)，見表2。

表2 3組大鼠心臟超聲指標(biāo)比較

2.2 3組大鼠心體質(zhì)量比比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心臟質(zhì)量、心體質(zhì)量比均增加(t/P=6.704/0.000、9.664/0.000)。與模型組比較，小檗堿組大鼠心臟質(zhì)量、心體質(zhì)量比減小(t/P=3.929/0.004、3.866/0.005)。3組大鼠體質(zhì)量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 3組大鼠心臟質(zhì)量、體質(zhì)量比較

2.3 3組大鼠心肌組織中ANP、BNP及miR-21-3p表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織ANP、BNP、miR-21-3p表達(dá)水平明顯上調(diào)(t/P=17.043/0.000、22.445/0.000、24.254/0.000)；與模型組比較，小檗堿組大鼠心肌組織ANP、BNP、miR-21-3p表達(dá)水平顯著下調(diào)(t/P=8.845/0.000、9.514/0.000、15.376/0.000)，見圖1。

注：ANP.心房鈉尿肽；BNP.腦鈉肽；miRNA-21-3p.微小RNA-21-3p。與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.4 3組大鼠心肌組織中AKT、GSK3β蛋白及磷酸化水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織p-AKT、p-GSK3β蛋白水平顯著上調(diào)(t/P=22.767/0.000、28.647/0.000)；與模型組比較，小檗堿組大鼠心肌組織p-AKT及p-GSK3β蛋白水平顯著下調(diào)(t/P=20.090/0.000、27.945/0.000)，而3組大鼠AKT、GSK3β的蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

注：A.蛋白表達(dá)免疫印跡圖；B.蛋白定量表達(dá)比較。與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

3 討 論

心肌肥厚是指心肌組織應(yīng)對心臟負(fù)荷的一種代償性反應(yīng)，早期肥大的心肌細(xì)胞可以減輕心室壁的壓力維持足夠的心排出量，但長期持續(xù)的高負(fù)荷狀態(tài)最終引起心臟失代償，導(dǎo)致心室的收縮及舒張功能障礙，最終發(fā)展成心力衰竭[6]。心肌肥厚包括心肌細(xì)胞的體積增大及心肌間質(zhì)細(xì)胞的增生，多個基因及信號通路參與心肌肥厚的過程[7]，但其具體機(jī)制尚未闡明。雖然有研究證實，神經(jīng)體液機(jī)制參與了心肌肥厚的過程，但是對晚期心力衰竭患者的癥狀控制及遠(yuǎn)期預(yù)后的治療依舊欠佳。因此，探究心肌肥厚的發(fā)病過程及其具體的作用機(jī)制，尋找針對心肌肥厚的潛在作用靶點(diǎn)，減輕心臟失代償?shù)炔l(fā)癥的發(fā)生，延緩心力衰竭的進(jìn)展具有重要的臨床意義。

miRNA是一種內(nèi)源性非編碼小RNA，大量的證據(jù)表明，miRNA在心肌肥厚過程中發(fā)揮著重要作用，成為治療心肌肥厚的潛在生物靶點(diǎn)[3, 8-9]。miR-1通過抑制Hand2的表達(dá)，以及抑制胰島素樣生長因子(IGF1)和細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)因子Twf1的活性來防止心肌肥厚[10]。miR-223通過靶向心肌肌鈣蛋白I作用激酶(TNNI3K)，拮抗ECE-1或主動脈縮窄(TAC)誘導(dǎo)的心肌肥厚[11]。研究發(fā)現(xiàn)，在TAC或其他方式誘導(dǎo)的心肌肥厚模型中miR-21表達(dá)明顯上調(diào)[12]，作為miR-21的互補(bǔ)序列miR-21-3p是否在心肌肥厚模型發(fā)揮作用尚未明確。筆者構(gòu)建了心肌肥厚模型，發(fā)現(xiàn)miR-21-3p在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚模型中同樣表達(dá)上調(diào)。同樣在Yan[13]的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-21-3p在TAC術(shù)后4周的心力衰竭模型中表達(dá)增高，而在TAC術(shù)后2周的心肌肥厚模型中表達(dá)下調(diào)，提示miR-21-3p在心肌肥厚不同階段發(fā)揮不同的作用。本研究中在腹主動脈縮窄術(shù)40 d后發(fā)現(xiàn)miR-21-3p的表達(dá)水平上調(diào)，且反映心力衰竭的特殊標(biāo)志物ANP及BNP表達(dá)水平同樣上調(diào)，提示本研究運(yùn)用腹主動脈縮窄法構(gòu)建的心肌肥厚模型為心力衰竭模型，這一表型與Yan等[13]在TAC術(shù)后4周的表型基本一致。

小檗堿是一種從植物中提取的異喹啉類生物堿，具有一定的抗心肌肥厚作用[2]，其可能通過調(diào)節(jié)Rho/ROCK信號途徑及其底物磷酸化水平達(dá)到改善心肌肥厚的目的，而在本研究中發(fā)現(xiàn)，小檗堿通過抑制miR-21-3p水平從而抑制AKT/GSK3β信號通路達(dá)到抗心肌肥厚的作用。本研究發(fā)現(xiàn)在構(gòu)建心肌肥厚模型40 d后，經(jīng)小檗堿處理后大鼠心臟質(zhì)量、心體質(zhì)量比、左心室舒張末期后壁厚度減小，左心室舒張末期內(nèi)徑、左心室射血分?jǐn)?shù)增加，提示在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚模型中小檗堿能夠抑制心肌肥厚、改善心功能。更重要是的，經(jīng)小檗堿處理后miR-21-3p的表達(dá)水平明顯下調(diào)，提示小檗堿抑制心肌肥厚的作用可能與miR-21-3p的表達(dá)相關(guān)，且與這種表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。AKT信號通路是心肌肥厚發(fā)生及發(fā)展過程中的關(guān)鍵因子，其下游靶點(diǎn)GSK3β同樣參與了這一過程[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)miR-21-3p依賴HDAC8調(diào)控AKT/GSK3β信號通路參與心肌肥厚過程[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，心肌肥厚模型經(jīng)小檗堿處理后miR-21-3p表達(dá)水平明顯下調(diào)，而且AKT及GSK3β磷酸化水平較模型組明顯下調(diào)，進(jìn)一步證實了小檗堿可能通過抑制AKT/GSK3β信號通路抑制心肌肥厚。然而本研究未檢測心肌肥厚模型中HDAC8的表達(dá)水平，不能確認(rèn)小檗堿是否也依賴HDAC8發(fā)揮作用，為接下來研究小檗堿的抗心肌肥厚作用機(jī)制提供了新的思路。

綜上所述，本研究在動物模型水平提示了小檗堿通過AKT/GSK3β信號通路抑制心肌肥厚，且這一作用與miR-21-3p的表達(dá)相關(guān)，為臨床治療心肌肥厚提供了新的思路。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

劉盛祥：課題設(shè)計及文章撰寫；黃宇鵬：數(shù)據(jù)獲取及統(tǒng)計分析；楊國康：收集資料及論文修改；金紅艷：課題指導(dǎo)