毛帥，王順，顏輝，楊曼琪，吳鋼

心肌肥厚是心臟應(yīng)對壓力超負(fù)荷等各種刺激發(fā)生的一種適應(yīng)性反應(yīng)，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞面積增大、間質(zhì)增殖、血管生成增多、心室壁變厚等。心肌肥厚分為2種類型：妊娠、運(yùn)動等引起生理性心肌肥厚，在刺激消失后往往會逆轉(zhuǎn)；而心肌梗死、高血壓等常導(dǎo)致病理性心肌肥厚,長期持續(xù)的病理性刺激會發(fā)生不良的后果，如心律失常、心力衰竭和心源性猝死等[1]。因此，如何干預(yù)病理性心肌肥厚并延緩病情的進(jìn)程成為研究的重點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)，在病理性心肌肥厚過程中，會發(fā)生所謂的“能量代謝重編程”[2]。即在正常情況下，心臟的能量來源70%～90%來自脂肪酸，然而病理性心肌肥厚后期甚至心力衰竭時(shí)，心臟主要利用糖酵解途徑供能[3]。同源性2b銜接蛋白1(Src homology 2 binding protein 1, SH2B1) 屬于SH2B家族，是含有SH2和PH結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白，編碼的蛋白質(zhì)介導(dǎo)各種激酶的激活，并可能在細(xì)胞因子和生長因子受體信號傳導(dǎo)以及細(xì)胞轉(zhuǎn)化中起作用，其缺失會導(dǎo)致嚴(yán)重的肥胖及瘦素、胰島素抵抗[4-5]。已有研究證實(shí)SH2B1與糖尿病患者心肌梗死、冠心病發(fā)生率密切相關(guān)。然而，關(guān)于其在病理性心肌肥厚中扮演的角色以及發(fā)揮作用的主要機(jī)制目前尚不清楚?，F(xiàn)觀察在AngⅡ誘導(dǎo)心肌肥大過程中，SH2B1對心肌細(xì)胞糖代謝的影響，探討相關(guān)機(jī)制，為心肌肥厚的臨床治療提供新的治療靶標(biāo)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 (1)原代大鼠：新生1～3 d乳鼠，雌雄不限，購于湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：42000600016516。(2)試劑試藥：抗體SH2B1(R&D Systems)，AMPK、p-AMPK、G6PD、GAPDH及HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG均購自Cell Signaling Technology ，TRIzol均購自invitrogen，cDNA合成試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix均購自Roche，RIPA裂解液均購自碧云天，BCA蛋白定量試劑盒均購自普利萊。PVDF膜購自Millipore， DMEM均購自Gibco, Opti-MEM均購自Gibco， iMAX均購自invitrogen，AngⅡ、 AMPK抑制劑compound C均購自Sigma-Aldrich。(3)儀器設(shè)備：倒置顯微鏡，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad), 細(xì)胞培養(yǎng)箱，LightCyclerR 480(Roche)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳鼠心肌細(xì)胞分離和處理：2016年6月—2017年2月于武漢大學(xué)第一臨床學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。選取1～3 d新生乳大鼠，處死后取出心臟,置于預(yù)冷PBS緩沖液中清洗2～3次,修剪心臟除去多余的血管、心房；將心臟置入0.125%胰酶中稍剪開但不剪碎,再放入15 ml離心管中,加入0.125%胰酶10 ml靜置, 4℃過夜 ；第2天,吸出上清液,加入含0.035%膠原酶Ⅱ的消化液 6 ml,置于37℃水浴輕輕振搖3～5 min,待液體變混濁后即停止消化,重復(fù)消化6～7次。 收集上清液離心10 min,棄上清,加入適量含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,接種于10 cm培養(yǎng)皿中進(jìn)行差速貼壁1 h去除成纖維細(xì)胞,將細(xì)胞懸液接種于35 mm培養(yǎng)皿中,細(xì)胞密度為1×106,培養(yǎng)24 h后,用倒置顯微鏡觀察。

首先，將分離培養(yǎng)好的乳鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、AngⅡ組，每3只。對照組不予任何處理，AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的方法如下：將乳鼠心室肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h，棄去舊培養(yǎng)基，PBS洗1次，將AngⅡ稀釋于含1%雙抗+1%ITS的DMEM培養(yǎng)基中，終濃度為1 μmol/ml。加入AngⅡ刺激24 h后，收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

為了進(jìn)一步探索SH2B1在心肌肥厚中發(fā)揮的作用，將乳鼠心肌細(xì)胞分為對照組、AngⅡ組、siSH2B1組、siSH2B1+ AngⅡ組,每3只。使用invitrogen公司的iMAX轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按照使用說明書操作，以35 mm培養(yǎng)皿為例：鋪好乳鼠心室肌細(xì)胞24 h后，轉(zhuǎn)染前將完全培養(yǎng)基更換成含1%雙抗+1%ITS的DMEM培養(yǎng)基。配置轉(zhuǎn)染工作液，取4 μl siRNA,加入opti-MEM稀釋至總體積為100 μl,室溫放置。取iMAX 6 μl，加入opti-MEM稀釋至總體積為100 μl，室溫放置5 min。將稀釋的iMAX加入稀釋的siRNA中輕輕混勻，室溫放置15 min。將轉(zhuǎn)染工作液輕輕混勻，逐滴加入2 ml培養(yǎng)基中，輕輕混勻培養(yǎng)基，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。接著使用AMPK抑制劑compound C處理乳鼠心肌細(xì)胞，將乳鼠心肌細(xì)胞分為對照組、AngⅡ組、AngⅡ+compound C組，直接向含有2 ml培養(yǎng)基的心肌細(xì)胞中加入用5μmol 的AMPK抑制劑compound C處理細(xì)胞，45 min后再加入1 μmol AngⅡ，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2 熒光定量PCR檢測ANP、BNP基因表達(dá)：使用TRIzol從新鮮乳鼠心室肌細(xì)胞中提取總RNA。利用cDNA合成試劑盒合成cDNA。然后，采用SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行熒光定量PCR，以內(nèi)源性GAPDH為對照，量化目標(biāo)基因的相對表達(dá)水平。用于擴(kuò)增的引物序列如下：(1)心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)：5'-ATACAGTGCGGTGTCCAACA-3' (上游)和5'-AGCCCTCAGTTTGCTTTTCA-3'(下游)； (2)腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)：5'-CAGCTCTCAAAGGACCAAGG-3'(上游)和5'-GCAGCTTGAACTATGTGCCA-3'(下游)；(3)GAPDH：5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'(上游)和5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'(下游)。

1.2.3 Western Blot法檢測SH2B1、GLUT4、C6PD蛋白水平：用RIPA裂解液從新鮮乳鼠心室肌細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，形成蛋白溶液。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。通過SDS-PAGE對每個(gè)樣品中等量的蛋白質(zhì)(20 μg)進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h后，將這些膜與以下相對應(yīng)的一抗在4℃下孵育過夜：AMPK(1∶1 000)、p-AMPK(1∶1 000)、SH2B1(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)。然后，在室溫下與一抗相應(yīng)的辣根過氧化物酶結(jié)合二抗孵育2 h。后使用化學(xué)發(fā)光顯影液在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)上曝光顯示目標(biāo)條帶，并將目標(biāo)條帶用image J (National Institutes of Health)進(jìn)行量化分析。以GAPDH蛋白含量作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，得到每個(gè)樣本中目的蛋白的相對表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

1.1 AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大過程中SH2BI表達(dá)和糖代謝改變 與對照組比較，AngⅡ組ANP、BNP mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)，提示心肌肥厚造模成功(圖1A)。接著使用Western Blot檢測AngⅡ誘導(dǎo)組細(xì)胞中SH2B1蛋白水平的變化，結(jié)果顯示,與對照組相比，AngⅡ組SH2B1的蛋白表達(dá)水平上調(diào)(圖1 B,C)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)， Western Blot檢測AngⅡ誘導(dǎo)組細(xì)胞中GLUT4、G6PD蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示, 與對照組相比，AngⅡ組GLUT4、G6PD蛋白表達(dá)水平增加(圖1 D,E)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，在AngⅡ誘導(dǎo)心肌肥大過程中，SH2BI表達(dá)增加，糖代謝活動增強(qiáng)。

注：A.AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大后ANP、BNP的mRNA相對表達(dá)水平；B、C. AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大后SH2B1的電泳圖及比較；D、E. AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大后GLUT4、G6PD的電泳圖及比較。與對照組比較，aP<0.01

1.2 AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大過程中AMPK通路改變 與對照組相比，AngⅡ組AMPK基本不變，而其磷酸化增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2。表明在心肌肥大的過程中AMPK信號通路被激活。

注：A. AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大后AMPK、p-AMPK的電泳圖；B. AMPK磷酸化水平的量化比較。與對照組比較，aP<0.01

1.3 下調(diào)SH2B1對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大過程中糖代謝的影響 與siNeg組相比，siSH2B1 轉(zhuǎn)染后其表達(dá)量明顯下降(圖3 B,C)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即siSH2B1能成功敲低SH2B1的表達(dá)。與siNeg+AngⅡ組相比，siSH2BI +AngⅡ組GLUT4、G6PD蛋白表達(dá)減少(圖3D,E),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明SH2B1表達(dá)減少可抑制AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大過程中的糖代謝，減少心肌肥厚程度。

注：A. 心肌細(xì)胞肥厚指標(biāo)ANP、BNP的mRNA相對表達(dá)水平；B、C. 轉(zhuǎn)染siRNA后SH2B1的電泳圖及比較；D、E. 轉(zhuǎn)染siSH2B1后GLUT4、G6PD的電泳圖及比較。與對照組比較，aP<0.01; 與siNeg組比較，bP<0.05，cP<0.01

1.4 下調(diào)SH2B1對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大過程中信號通路AMPK的影響 與siNeg+AngⅡ組相比，siSH2BI +AngⅡ組AMPK的磷酸化水平減弱(圖4)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明SH2B1表達(dá)減低可抑制AMPK信號通路的激活。

注：A. 轉(zhuǎn)染siSH2B1后AMPK、p-AMPK的電泳圖；B.AMPK磷酸化水平的量化比較。與對照組比較，aP<0.01; 與siNeg組比較，bP<0.01

1.5 抑制AMPK通路對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大過程中糖代謝的影響 與對照組相比，AngⅡ組GLUT4、G6PD蛋白表達(dá)水平上調(diào)(圖5),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與AngⅡ組相比，compound C+ AngⅡ組的GLUT4、G6PD蛋白表達(dá)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明抑制AMPK通路可減輕AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大過程中的糖代謝。

注：A. 糖代謝相關(guān)蛋白GLUT4、G6PD的電泳圖；B. GLUT4、G6PD水平比較。與對照組比較，aP<0.05; 與AngⅡ組比較，bP<0.01

3 討 論

作為一種接頭蛋白，SH2B1在多種信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用，并且可以調(diào)控能量平衡、體質(zhì)量和糖代謝。以往研究重點(diǎn)多放在其與癌癥的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)SH2B1在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常[6-9]。Liu等[10]研究表明SH2B1在肺癌中高表達(dá)，miR-361可以直接靶向肺癌中SH2B1從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。近年來，SH2B1在心血管疾病中的研究逐漸增多。肥胖是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而SH2B1作為肥胖相關(guān)的基因，研究顯示其基因多態(tài)性與肥胖和非酒精性脂肪肝患者的脂肪變性的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[11]。Wu等[12]的研究直接揭示了SH2B1在壓力超負(fù)荷下通過激活JAK2/STAT3信號通路發(fā)揮促心肌肥厚的作用。Liu等[10]發(fā)現(xiàn)miR-142-3p能直接作用于SH2B1來改善病理性心肌肥厚并調(diào)控線粒體功能。然而，SH2B1是否參與病理性心肌肥厚代謝重編程的發(fā)生發(fā)展目前尚不清楚。本研究證實(shí)AngⅡ刺激乳鼠心肌細(xì)胞后，與對照組相比，SH2B1的蛋白表達(dá)水平增加，推測SH2B1的高表達(dá)可能與心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。使用siRNA沉默SH2B1時(shí)，SH2B1蛋白表達(dá)量明顯減少，提示siRNA轉(zhuǎn)染效果好。轉(zhuǎn)染siRNA48 h后，與AngⅡ組相比，siSH2B1+ AngⅡ組的心肌肥厚標(biāo)志物ANP、BNP顯著下降，這與既往報(bào)道一致。

在心肌肥厚進(jìn)展過程中，心臟更加偏好糖酵解供能，發(fā)生能量代謝重編程[13]。一方面將葡萄糖作為底物，能量利用效率更高，另一方面，糖酵解速率提升的同時(shí)生成了更多的質(zhì)子以及乳酸，而酸性環(huán)境將進(jìn)一步損傷心肌細(xì)胞[14]。目前普遍認(rèn)為這種心肌燃料代謝的異常促進(jìn)了心肌肥厚和心力衰竭的發(fā)展[15]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AMPK被稱作能量代謝的總開關(guān)，在糖代謝中發(fā)揮重要作用[16]。本研究中通過AngⅡ構(gòu)建心肌細(xì)胞肥大模型，發(fā)現(xiàn)在心肌肥厚過程中，糖酵解活動增強(qiáng)，而且伴隨著 “能量傳感器”AMPK的活化，GLUT4、G6PD蛋白表達(dá)也上調(diào)。而在一項(xiàng)新的研究中，APMK的強(qiáng)效變構(gòu)激活劑MK-8722能誘導(dǎo)持久的葡萄糖攝取和糖原合成，并且給藥1個(gè)月后，大鼠出現(xiàn)心臟重量增加并觀察到與心臟糖原增加相關(guān)聯(lián)的心臟肥大[17]。

SH2B1作為內(nèi)源性瘦素增敏劑，可增強(qiáng)瘦素的敏感性[18]。瘦素刺激JAK2的Tyr813位點(diǎn)使其自磷酸化[19]。而SH2B1通過其SH2結(jié)構(gòu)域與自磷酸化Tyr813位點(diǎn)結(jié)合，顯著增強(qiáng)JAK2活性，從而促進(jìn)JAK2下游瘦素信號通路的激活[19]。2002年，Barbara Kahn的實(shí)驗(yàn)室首次闡明AMPK在介導(dǎo)瘦素作用中扮演的關(guān)鍵角色，證明在骨骼肌中瘦素激活A(yù)MPK從而調(diào)控脂肪酸代謝。而最近研究發(fā)現(xiàn)瘦素可以調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化及米色脂肪轉(zhuǎn)化，這依賴于APMK信號通路的激活[20]。由此筆者推測SH2B1或許可以通過調(diào)控AMPK信號通路調(diào)節(jié)能量代謝過程。在本研究中，下調(diào)SH2B1的表達(dá)后，AMPK、GLUT4、G6PD蛋白水平顯著降低，提示沉默SH2B1可能抑制AMPK磷酸化，GLUT4、G6PD蛋白表達(dá)。而使用AMPK抑制劑compound C能達(dá)到與沉默SH2B1類似的效果，由此我們推測沉默SH2B1可能抑制了其對AMPK信號通路的激活作用，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大過程中糖酵解活動的下降，起到心臟保護(hù)作用。

總之，本研究表明，SH2B1可以通過AMPK介導(dǎo)的GLUT4促進(jìn)葡萄糖攝取，和G6PD促進(jìn)糖酵解中間產(chǎn)物的分解代謝，從而增加糖酵解通量。這一研究揭示了以前從未被認(rèn)識的SH2B1與心肌肥厚中能量代謝重編程之間的關(guān)系，為臨床治療病理性心肌肥厚提供新的靶點(diǎn)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

毛帥：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；王順：完善研究方案；顏輝、楊曼琪：分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)；吳鋼：提供研究方向，論文審核