陳垚宇，王 喆，王 昭，荊 鑫，張 強

（1.珠海市人民醫(yī)院普通外科，廣東 珠海 519000；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰脾外科）

全世界每年因為胰腺癌而死亡的人數(shù)大于200，000例[1]。我國最新的統(tǒng)計報告指出，每年發(fā)病人數(shù)接近10萬人，其中男性和女性分別約為5.4萬人和4.1萬人。而死亡人數(shù)更達到了8.4萬，男性約為4.8萬和女性約為3.6萬[2]。其進展快且隱匿，許多病人發(fā)病早期沒有任何癥狀，一旦出現(xiàn)腹痛、黃疸、貧血等癥狀時，病情可能達到晚期，從而喪失根治性手術(shù)機會，超過半數(shù)患者無法接受根治手術(shù)[3]。由于該病惡性度高、預(yù)后極差，為防止癌細胞殘留或癌癥復(fù)發(fā)，術(shù)后應(yīng)采取輔助化療。臨床上通常選用較5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）副作用少的吉西他濱（Gemcitabine，GEM）進行輔助化療[4，5]。隨著臨床應(yīng)用，人們逐漸發(fā)現(xiàn)GEM輔助化療個體間的效果不盡相同。一些胰腺癌組織對GEM化療敏感性欠佳，可能導(dǎo)致部分病人僅獲得有限的效果。因為hENT-1是介導(dǎo)GEM進入腫瘤細胞的主要運載體，所以部分學(xué)者認為其表達水平可能影響GEM輔助化療敏感性[6]。

人類平衡型核苷轉(zhuǎn)運體-1（Human equilibrative nucleoside transporter-1，hENT-1）是具有疏水α-螺旋結(jié)構(gòu)的跨膜蛋白[7，8]。該轉(zhuǎn)運體除在許多正常組織中分布外，亦在腫瘤中差異表達[21～25]。它不僅幫助轉(zhuǎn)運人體基本生理生化反應(yīng)過程中所需物質(zhì)，而且具備了轉(zhuǎn)運核苷類藥物的能力。親水性核苷類藥物GEM不能通過被動擴散的方式穿過細胞膜，所以需要依賴hENT-1進入胞漿[9]，以發(fā)揮抑制腫瘤生長效果。

理論上GEM可顯著提高胰腺癌病人的總生存期及無病生存期。但臨床上其療效卻有著明顯的差異，GEM敏感性差是延長病人OS和DFS的主要困難。至此，全世界學(xué)者們都在研究造成其敏感性不一的原因。可惜，時至今日，有關(guān)hENT-1是否影響胰腺癌GEM輔助化療敏感性的研究結(jié)論并未形成統(tǒng)一。如Farrell[6]認為hENT-1表達水平與胰腺癌GEM輔助化療敏感性相聯(lián)系，可影響病人的OS以及DFS。但是，Poplin[10]等學(xué)者則認為hENT1低表達對GEM化療敏感性無影響，病人之間的OS未見明顯差異。由于國內(nèi)有關(guān)hENT-1的研究缺乏，且此研究區(qū)域暫無有關(guān)文獻，故此次研究具有一定意義。

筆者對近5年附屬醫(yī)院胰腺癌GEM輔助化療的患者采取回顧性分析，并經(jīng)免疫組織化學(xué)手段測定胰腺癌組織中hENT1的表達水平，最后對相應(yīng)預(yù)后情況作出對比分析。

1 試劑與儀器

1.1 試劑

PBS緩沖液、DAB顯色液、中性樹膠、乙醇、修復(fù)液、蘇木素染色劑、兔多克隆抗hENT-1抗體等。

1.2 儀器

切片機、烤片機、展片臺、光學(xué)顯微鏡、顯微鏡攝像系統(tǒng)、冰箱、溫箱。

1.3 組織標(biāo)本

近5年附屬醫(yī)院55例胰腺導(dǎo)管腺癌切片。

2 病例收集及觀察指標(biāo)

2.1 實驗對象

入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）行胰腺癌根治術(shù)后，病理學(xué)診斷為導(dǎo)管腺癌；（2）未行新輔助放、化療；（3）經(jīng)GEM為主輔助化療；（4）滿足免疫組織化學(xué)手段標(biāo)本；（5）臨床資料，如年齡、性別、民族、飲酒情況、腫瘤位置、腫瘤大小、病理級別、TNM分期、術(shù)式無明顯缺失；（6）無較為嚴(yán)重的并發(fā)癥；（7）隨訪至2020.01.01。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有嚴(yán)重心、肺、腦、腎、免疫缺陷等基礎(chǔ)疾病；（2）腫瘤晚期或TxNxM1，無法行根治術(shù)；（3）病人失訪或拒絕規(guī)律隨訪病情。

2.2 觀察指標(biāo)

（1）經(jīng)免疫組化后hENT-1的染色強度、范圍；（2）總體生存期和無病生存期；（3）年齡、性別、民族等情況；（4）腫瘤位置及直徑、術(shù)式、病理級別、TNM分期。

3 實驗方法

3.1 制作胰腺癌切片

3.2 免疫組化染色

按順序進行：脫蠟→水化→抗原修復(fù)→去除內(nèi)源性過氧化物酶→封閉→孵育一抗→孵育二抗→DAB顯色→蘇木素復(fù)染→分化→返藍→脫水→透明→封片。

3.3 免疫組織化學(xué)評分

將染色強度分為4級，利用同一切片中淋巴細胞的著色度進行標(biāo)準(zhǔn)化，3分即強著色，腫瘤細胞的染色程度高于淋巴細胞；2分即中等著色，兩種細胞染色程度一致；1分即淺著色，腫瘤細胞的染色程度弱于淋巴細胞；0分即無著色。而染色范圍計分即評估單張切片范圍內(nèi)著色的腫瘤細胞占該切片總腫瘤細胞的比例，4分：＞50%陽性，3分：26%～50%陽性；2分：11%～25%陽性；1分：≤10%陽性；0分：細胞呈陰性或比例＜1%。最終，hENT-1染色水平評分由上述兩項相加，強陽性（++）：≥7分；陽性（+）：5～6分；弱陽性（+-）：3～4分；陰性（-）：＜2分。低表達組由陰性及弱陽性組組成，高表達組則由陽性及強陽性組組成。

4 醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)分析

利用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 20.0分析，正態(tài)分布數(shù)值以（±s）表示，計量資料采用方差分析或t檢驗。而計數(shù)資料應(yīng)用卡方檢驗以及Fisher精確檢驗（當(dāng)期望值＜5時）。以Kaplan-Meier生存曲線分析OS和DFS與hENT-1表達水平的相關(guān)性。病人的獨立預(yù)后因素分別以Log-rank檢驗及Cox regression模型進行分析。檢驗水準(zhǔn)為α＝0.05，P＜0.05即差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。

5 結(jié)果

5.1 hENT-1表達水平與病人預(yù)后的單因素生存分析

經(jīng)Kaplan-Meier分析后示，hENT-1高表達組與低表達組的中位OS分別是20個月對10個月（見圖1），而DFS是15個月對6個月（見圖2）。hENT-1高表達組的OS及DFS明顯優(yōu)于低表達組。

圖1 hENT-1表達水平與OS的KM生存曲線

圖2 hENT-1表達水平與DFS的KM生存曲線

5.2 hENT-1表達水平與病人預(yù)后的多因素生存分析

經(jīng)Cox regression分析臨床資料中的變量后，其結(jié)果表明OS的獨立預(yù)后因素是hENT-1表達水平、病理級別和淋巴轉(zhuǎn)移情況（P＜0.05）。DFS的獨立預(yù)后因素是hENT-1表達水平和病理級別（P＜0.05）。

5.3 臨床資料與hENT-1表達水平

hENT-1表達水平分別與計量資料（病人年齡、腫瘤直徑）經(jīng)t檢驗后，暫無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），以及與計數(shù)資料（性別、民族、飲酒情況、腫瘤位置和病理等級）行χ2檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。因此，臨床資料與hENT-1蛋白表達水平無相關(guān)性，暫不能認為其對hENT-1表達水平有影響。

6 討論

指南指出[12]，GEM是胰腺癌輔助化療的一線藥物。基本生命功能平穩(wěn)的病人術(shù)后應(yīng)積極使用GEM輔助化療。但是，化療前未知GEM化療敏感情況時，很難制訂最佳的化療方案。若有標(biāo)記物能夠預(yù)測胰腺腫瘤對GEM輔助化療敏感性，可為化療藥物選擇提供思路，從而制訂個體治療方案。本研究發(fā)現(xiàn)hENT-1高表達病人比低表達病人使用GEM輔助化療生存期更長、敏感性更高，對GEM耐藥的可能性更低。而且，在GEM輔助化療下，其OS的獨立預(yù)后因素是hENT-1表達水平、病理級別和淋巴轉(zhuǎn)移情況（P＜0.05）。而DFS的獨立預(yù)后因素是hENT-1表達水平和病理級別（P＜0.05）。因此根據(jù)hENT-1表達水平預(yù)測胰腺癌術(shù)后GEM輔助化療效果有一定意義。但是，過往研究表明有爭議發(fā)生。Farell[6]等學(xué)者發(fā)現(xiàn)GEM組hENT-1表達與病人OS和DFS相關(guān)，而5-FU組則未見相關(guān)性，但該實驗將免疫組化染色結(jié)果分為3個等級，即＞50%腫瘤細胞染色的為高染色；＜50%染色者為無染色；介于兩者之間的為低染色。但上述分級方法忽略了染色強度深淺的情況。幾年后，Marechal等[13]也發(fā)現(xiàn)接受GEM化療的病人，hENT-1高表達與更長的生存期顯著相關(guān)（HR 0.34，P＜0.05），而未接受輔助化療的病人以及其他化療組無上述情況。而且，hENT-1是GEM輔助化療預(yù)后的獨立影響因素。由于胰腺癌復(fù)發(fā)率高，術(shù)后基本生命功能平穩(wěn)的病人鮮有不進行輔助化療的，且不接受輔助化療病人無法追蹤，所以本研究無法構(gòu)建非化療組，該方向研究需等待下一階段進行。Marechal[13]及Oba[15]都認為hENT-1高表達病人更應(yīng)選擇GEM行輔助化療，因為高表達者獲益更多。對于hENT-1低表達的病人，有學(xué)者[14]認為不應(yīng)采取GEM作為化療方案的主要藥物，因為低表達的病人術(shù)后使用GEM化療所獲得的效果欠佳。而5-FU相比之下具有更好的獲益，并且ESPAC-3試驗[14]亦證實這一點。

雖然hENT-1表達水平與胰腺癌GEM輔助化療療效具有相關(guān)性的觀點獲得以上研究支持，但仍有不少學(xué)者對此作出反對。如Fisher等[16]指出在GEM輔助化療中，hENT-1高表達水平者與OS無關(guān)，無法作為主要標(biāo)記物來預(yù)測該藥化療敏感性。Ormanns等[11]則 利 用AIO-PK0104的 臨 床 資 料 進 行兩次實驗，所有結(jié)果均無法支持hENT-1可以作為預(yù)測性生物標(biāo)記物。除此之外，一些學(xué)者[17，18]甚至懷疑hENT-1表達與GEM敏感性存在差異可能與免疫組化中所選擇的hENT-1抗體種類有關(guān)，如SP120兔抗體對測定的hENT-1表達水平可能存在缺陷。針對該情況，Kalloger等[19]認為10D7G2單克隆抗體和SP120多克隆抗體，均可檢測出hENT-1的表達水平。而且，兩者可相互補充某種有意義的信息，令研究對象分層更加全面，如療效的分層。

本研究探討胰腺癌hENT-1表達水平對吉西他濱輔助化療的影響，所入組的病人均接受胰腺癌根治術(shù)，并排除了其他明顯影響生存期的疾病。筆者認為同時使用10D7G2單克隆抗體和SP120多克隆抗體進行測定可以更全面地對病人hENT-1表達水平作出準(zhǔn)確的評估。但是由于10D7G2國內(nèi)無大量生產(chǎn)，以至獲取困難，故本次研究僅選用SP120多克隆抗體。本次染色評分綜合染色強度及范圍，可大大減少因顯色條件差而產(chǎn)生的誤判，臨床上采用該方法具有確切意義。本次研究所覆蓋到的范圍有限，無法對全國不同地區(qū)人群展開研究。今后仍需各位學(xué)者進行更深一步探研。

7 結(jié)論

hENT-1表達水平與GEM輔助化療預(yù)后相關(guān)。hENT-1高表達的病人比低表達者有更長的OS和DFS，說明高表達者的GEM敏感性更高。檢測hENT-1表達水平具有預(yù)測吉西他濱療效的意義。hENT-1表達水平和病理級別共同影響病人的OS和DFS，卻互不牽涉，其機制暫不明確。年齡、性別、腫瘤位置及大小、術(shù)式、TNM分期等暫未發(fā)現(xiàn)對hENT-1表達水平造成影響。