崔傳波，葛慶曼，徐志鴻，牟國(guó)營(yíng)

(1山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，山東 臨沂 276000；2山東醫(yī)專附屬眼科醫(yī)院；3臨沂市中醫(yī)醫(yī)院；4山東省立醫(yī)院)

角膜交聯(lián)術(shù)(Corneal crosslinking，CXL)是采用紫外線A光和光敏劑核黃素誘導(dǎo)角膜膠原纖維相互交聯(lián)，從而提高角膜硬度和改善角膜生物學(xué)性能的新方法[1]。該法的有效開展主要依賴于紫外線A與核黃素之間的光化學(xué)反應(yīng)，其強(qiáng)度主要取決于紫外線A光能量的吸收量，產(chǎn)生的生物效應(yīng)與組織對(duì)紫外線A光的總吸收量成正比[2]。因此，臨床上開創(chuàng)了多種快速角膜交聯(lián)模式，在保證總吸收量不變的情況下，通過提高紫外線A光照射能量和縮短照射時(shí)間，以達(dá)到相同的交聯(lián)效果。目前，常用的紫外線交聯(lián)模式有以下幾種：3 mW/cm2×30 min、9 mW/cm2×10 min、18 mW/cm2×5 min、30 mW/cm2×3 min。已有文獻(xiàn)從交聯(lián)過程中氧氣的消耗來分析不同能量紫外線在不同時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致不同角膜生物力學(xué)改變[2]，但核黃素濃度在交聯(lián)過程中的變化卻未見報(bào)道。為此，本研究進(jìn)行了相關(guān)探討。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備 新鮮羊角膜96只、0.1%的核黃素溶液、玻璃器皿；紫外線角膜交聯(lián)儀(美國(guó)Ave-dro，KXL系統(tǒng))，電子分析天平秤(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司，F(xiàn)A2204N)，高效液相色譜儀(日本SHIMADZU，LC-20AT SPD-20A)。

1.2方法 將新鮮羊角膜去上皮后置于玻璃器皿中，用0.1%的核黃素溶液每2 min點(diǎn)角膜1 次，持續(xù)30 min后隨機(jī)取出6只測(cè)定核黃素濃度；其余90只分成3組，每個(gè)模式組30只，分別用3、9、18 mW/cm2的紫外線(370 nm)進(jìn)行照射。核黃素濃度：3 mW/cm2組分別于照射后5、10、15、20、30 min檢測(cè)；9 mW/cm2組分別于照射后2、4、6、8、10 min檢測(cè)；18 mW/cm2組分別于照射后1、2、3、4、5 min檢測(cè)。各時(shí)間點(diǎn)均取6只角膜，取照射中央直徑8 mm角膜片，電子分析天平秤重后制成勻漿液，用高效液相色譜法檢測(cè)核黃素的濃度。

2 結(jié)果

各組角膜交聯(lián)開始后，角膜基質(zhì)內(nèi)核黃素濃度均快速下降(F=10.52～17.62，P<0.01)；3 mW/cm2×30 min模式于第2個(gè)時(shí)間點(diǎn)即10 min時(shí)角膜基質(zhì)內(nèi)濃度較低(P<0.05)；9 mW/cm2×10 min模式于第4個(gè)時(shí)間點(diǎn)即8 min時(shí)，角膜基質(zhì)內(nèi)核黃素濃度較低(P<0.05)；18 mW/cm2×5 min模式于第2個(gè)時(shí)間點(diǎn)即2 min時(shí)角膜基質(zhì)內(nèi)濃度最低(P<0.05)。見表1。

表1 三種模式不同時(shí)間點(diǎn)角膜內(nèi)核黃素濃度變化情況

3 討論

CXL是近年臨床常用的角膜成形術(shù)，能夠有效阻止或減緩圓錐角膜、準(zhǔn)分子激光術(shù)后角膜擴(kuò)張以及難治性角膜潰瘍等[3-4]，減少了不必要的角膜移植，有助于解決我國(guó)角膜供體嚴(yán)重缺乏的難題。核黃素由特征性的異咯嗪環(huán)系統(tǒng)組成，具有光敏特性，在反應(yīng)中形成核糖醇基側(cè)鏈，在較短時(shí)間內(nèi)分解為黃光素和黃色素。核黃素在交聯(lián)過程中起到關(guān)鍵作用：一是在紫外線A照射下產(chǎn)生活性氧基，誘導(dǎo)膠原纖維間形成新的連接[5]；二是提高紫外線A的吸收率，從而保護(hù)角膜內(nèi)皮、晶狀體及視網(wǎng)膜等眼部結(jié)構(gòu)[6]；三是在交聯(lián)過程中潤(rùn)滑暴露于空氣中的組織以防干燥。角膜交聯(lián)使用370納米波長(zhǎng)的紫外線，核黃素吸收UVA能量，電子遷移到高能級(jí)軌道，使核黃素分子被激發(fā)至三線態(tài)(3Rf)，誘發(fā)Ⅰ、Ⅱ型光化學(xué)反應(yīng)，形成角膜膠原纖維間化學(xué)共價(jià)鍵，使角膜膠原纖維直徑增粗，提高角膜基質(zhì)對(duì)多種降解酶作用的抵抗力等多重生物學(xué)效應(yīng)，從而使角膜基質(zhì)的機(jī)械強(qiáng)度增加。因此，角膜基質(zhì)內(nèi)核黃素濃度可能會(huì)影響Ⅰ、Ⅱ型光化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)程，從而影響角膜膠原纖維間化學(xué)共價(jià)鍵的形成。

有研究提出角膜基質(zhì)內(nèi)核黃素需達(dá)到15 μg/g的濃度才能安全、有效地開展膠原交聯(lián)。本研究首次檢測(cè)了臨床常用的三種不同交聯(lián)模式下角膜基質(zhì)內(nèi)核黃素濃度，發(fā)現(xiàn)所有角膜在交聯(lián)開始后不同時(shí)間的基質(zhì)內(nèi)核黃素濃度存在差異，說明不同紫外線照射強(qiáng)度對(duì)核黃素分子的激發(fā)作用不同；本研究還觀察到紫外線強(qiáng)度越大，核黃素消耗的速度越快，可能核黃素的消耗與紫外線的強(qiáng)度有相關(guān)性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)3 mW/cm2×30 min模式和18 mW/cm2×5 min模式角膜基質(zhì)內(nèi)核黃素濃度均能滿足臨床需要，僅有9 mW/cm2×10 min模式段時(shí)間內(nèi)不能滿足交聯(lián)需要。因此，需進(jìn)一步尋求交聯(lián)過程中核黃素的給藥方法。