孟建宇 張婷婷 楊麗華

摘? ? 要：以內蒙古巴丹吉林沙地藥用植物梭梭為材料，采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術，使用有機磷培養(yǎng)基對梭梭根際解磷菌進行分離，基于16S rRNA基因序列分析進行分類鑒定，采用釩鉬比色法測定其解有機磷能力，以植酸酶活性表示。從梭梭根際土壤中分離純化得到8株解有機磷細菌，分屬根瘤菌屬（Rhizobium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、泛菌屬（Pantoea）、馬西利亞菌屬（Massilia）和節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）。變形菌門（Proteobacteria）是梭梭根際極優(yōu)勢類群，占總數(shù)的87.5%。其中，菌株Y29 和B333解有機磷能力最強，植酸酶活分別為24.21，20.43 μg·mL-1，是2株極具開發(fā)潛力的解磷菌。本文揭示了梭梭根際可培養(yǎng)解有機磷細菌的類群組成，為認識和利用荒漠解磷菌提供了理論依據。

關鍵詞：梭梭;根際;有機磷降解菌;植酸酶活性;16S rRNA

中圖分類號：S567? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.08.001

Isolation of Organophosphate-degradation Bacteria from Rhizosphere of Haloxylon ammodendron and Their Organophosphate-degradation? Capability

MENG Jianyu，ZHANG Tingting， YANG Lihua

（Life Sciences College，InnerMongolia Agricultural University， Hohhot 010011， China）

Abstract：Traditional isolation and culture technology and organic phosphorus media were used to isolate organophosphate-degradation bacteria in the rhizosphere of medicinal plant Haloxylon ammodendron from the sandland of Badainjaran in Inner Mongolia. A preliminary identification was based on the 16S rRNA gene.Vanadium-ammonium-molybdate was used to measure the organophosphate-degradation capabilities， and the organophosphate-degradation cability was indicated by phytase activity. The results showed that a total of 8 organophosphate-degradation bacteria were isolated， which belonged to Rhizobium，Sphingomona， Pseudomonas，Enterobacter，Pantoea，Massilia and Arthrobacter， respectively. The Extremely dominant class was Proteobacteria with ratio of 87.5%. The strains Y29 and B333 had the strongest ganophosphate-degradation ability， and the phytase activity was 24.21， 20.43 μg·mL-1， respectively，which were of great potential applicationvalue. This study preliminarily revealed the composition of cultivable organophosphate-degradation bacteria from rhizosphere of Haloxylon ammodendron， which provides a basis for understanding and using desert organophosphate-degradation bacteria for applications.

Key words： Haloxylon ammodendron;rhizosphere;organophosphate-degradation bacteria;phytaseactivity;16S rRNA

磷是植物生長所需的大量元素、養(yǎng)分資源，對植物的抗逆性、抗病性和光合作用都有影響[1]。土壤中總磷（Total phosphorus，TP）含量較高，但生物可利用磷（Bioavailable phosphorus，BAP）僅占TP 的0.1 %[2]。BAP 的匱乏導致植物獲取有效磷受限，重影響作物的正常生長[2-3]。施加磷肥是提高BAP 的主要方法，但過量添加無機磷會對環(huán)境的健康造成嚴重影響[4]，因其在施用過程中會對農作物、大氣、土壤等造成影響，對人或動物的毒害越來越大[5-6]，成為21世紀全球環(huán)境的挑戰(zhàn)[7-8]。

土壤中存在大量解磷微生物（Phosphorus solubilizing microorganism，PSM）可以提高植物對磷的需求，并且廣泛參與不可溶性磷的轉化[9]。微生物分泌特異的酶，如堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和植酸酶等，通過這些酶的催化作用，將植酸鹽等不可溶的有機磷酸鹽迅速分解成可溶性小分子[10]，也可以通過分解有機質的磷-酯鍵和磷-酐鍵而釋放磷[11]，在磷的轉化過程中發(fā)揮至關重要的作用[9]。解磷微生物基因信息豐富、代謝類型多樣、生長周期短，使得微生物降解效率高、條件溫和且成本低，具有良好的應用前景[12]。但目前對于以植酸磷為惟一磷源的有機磷降解菌的研究還較少[6]。

梭梭抗旱、抗熱、抗寒、耐鹽堿性都很強，防風固沙能力強，是我國西北和內蒙古干旱荒漠地區(qū)固沙造林的優(yōu)良樹種，而且是一種名貴的中藥材，可清肺化痰、降血脂、降血壓和殺菌等。本研究選擇以植酸鈣為唯一磷源，從梭梭根際土中分離高效有機磷降解菌，以期認識和利用荒漠中解磷菌類群，為降解有機磷的微生物肥料提供高效穩(wěn)定的菌種來源及基礎資料，對于維護干旱荒漠地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定，改善荒漠化狀態(tài)具有重要的意義和應用價值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品 樣品為采集自內蒙古阿拉善巴丹吉林梭梭根際土，用已滅菌的刷子輕輕將梭梭根際土刷至聚乙烯塑料無菌采樣袋中，4 ℃保存運回實驗室。1.1.2 培養(yǎng)基 1/2R2A培養(yǎng)基：酵母膏0.25 g，蛋白胨0.25 g，酸水解絡素0.25 g，葡萄糖0.25 g，淀粉0.25 g，磷酸氫二鉀0.15 g，丙酮酸鈉0.15 g，硫酸鎂0.025 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，酵母粉5 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖15 g，蛋白胨3 g，可溶性淀粉20 g，硫酸銨0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸錳0.3 g，硫酸亞鐵0.3 g，磷酸二氫鉀0.4 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.5。

有機磷培養(yǎng)基：取2 mL植酸溶于400 mL去離子水中;取6 g醋酸鈣于100 mL去離子水中;將二者緩慢攪拌混勻。將混合液不斷攪拌，并加熱至沸騰，冷卻至室溫，于4 ℃過夜。將葡萄糖10 g，硫酸銨0.5 g，氯化鈉0.3 g，氯化鉀0.3 g，硫酸鎂0.3 g，硫酸亞鐵0.03 g，硫酸錳0.03 g加入混合液，并補水至1 000 mL，調節(jié)pH 7.0～7.5。制備固體培養(yǎng)基時加入20.0 g瓊脂。

1.2 解磷菌的分離鑒定

稱取植物根際土 0.5 g，加入 49.5 mL無菌水，震蕩 30 min，靜置 10 min。吸取 1 mL上清液，用無菌水稀釋成 10-6～10-2五個梯度，各自涂布在固體有機磷培養(yǎng)基，每個梯度設3個平行。28 ℃條件下培養(yǎng)1周，挑取形態(tài)各異的單菌落，用四區(qū)劃線法劃線培養(yǎng)，連續(xù)觀察7 d，記錄菌株的生長能力：第1天接菌，第2天開始觀察，第3天記錄，第3天長出的菌，記為“+++++”，第4天長出的菌，標記為“++++”，依此類推，第7天長出的菌，標為“+”，若第7天還未生長，則標為“-”。

利用細菌通用引物27F和1492R對分離得到的菌株進行16S rRNA基因PCR擴增[13]，擴增產物送生上海工生物工程股份有限公司進行測序，利用EzTaxon對測序所得16S rDNA片段序列進行同源性分析，以確定菌株的種屬關系。

1.3 解磷能力測定

采用釩鉬比色法[14]對菌株進行解磷能力測定。將分離的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、170 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)過夜。取適量發(fā)酵液，在10 000 r·min-1的離心機中離心10 min，取1 mL上清液，加入1 mL 5 mmol·L-1植酸鈉，37 ℃保溫30 min，再添加3 mL終止液中止反應，充分振蕩，靜置15 min后，4 000 r·min-1離心15 min，然后在波長415 nm處測定吸光值。根據磷標準曲線計算酶活，每個樣品均做3個平行。酶活力單位（IU）的定義為：37 ℃、pH 5.5的條件下，從濃度為8.4 g·L-1的植酸鈉溶液里每分鐘所釋放出1 μmol有機磷所需要的植酸酶量。以415 nm波長下測得的吸光值為X軸、標準磷濃度為Y軸繪制有機磷標準曲線（圖1），其方程式為y=12.652x+0.006（R2=0.9948），符合使用標準。

2 結果與分析

2.1 解磷菌的分離與鑒定

使用有機磷細菌培養(yǎng)基，對內蒙古阿拉善巴丹吉林梭梭根際解磷細菌進行分離培養(yǎng)，共篩選得到具有解有機磷-植酸磷能力的解磷細菌8株（表1）。分別以8株解磷菌的基因組DNA為模板進行16S rRNA基因擴增，擴增片段測序后在EzTaxon數(shù)據庫中進行相似性分析（表2）。變形菌門（Proteobacteria）為主要類群，共有7株，占總數(shù)的87.5%，其中α-變形菌綱（α-Proteobacteria）有3株，菌株B58、B280屬于根瘤菌屬（Rhizobium），B174屬于鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）;γ-變形菌綱（γ-Proteobacteria）有3株，W78屬于假單胞菌屬（Pseudomonas），B9屬于腸桿菌屬（Enterobacter），W29屬于泛菌屬（Pantoea）;β-變形菌綱（α-Proteobacteria）有1株，屬于馬西利亞菌屬（Massilia）的B333。放線菌門有1株，屬于節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）的Y29。

2.2 解有機磷能力

用釩鉬比色法對8株菌進行解有機磷-植酸磷能力的定量測定，測定結果如圖2所示。這些菌株植酸酶活力在1.61～24.21 μg·mL-1。菌株Y29和B333解有機磷能力最強，植酸酶活分別為（24.21±1.21）μg·mL-1和（20.43±1.02） μg·mL-1，W78株植酸酶活力為16.54±0.83 μg·mL-1，B58株植酸酶活力為11.77±0.58 μg·mL-1，菌株B9植酸酶活力為9.14±0.45 μg·mL-1，B174、W29解有機磷能力最弱，植酸酶活都小于2 μg·mL-1。

3 結論與討論

從環(huán)境中分離有機磷高效降解微生物，研制解磷功能的微生物有機肥對解決植物可溶性磷供應問題是一有效途徑[15]。近年來，有機磷降解菌的應用逐步引起人們的關注，并在農作物上已有應用報道[16]，但其在荒漠固沙植物上的應用卻鮮有報道，特別是中藥材根際解有機磷細菌研究較少[17]。

自然界中的部分功能微生物對有機磷具有降解作用，研究比較深入的是細菌和真菌。細菌主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、黃桿菌屬（Xanthomonas）、固氮菌屬（Azotobacter）和硫桿菌屬（Thiobacillus）等。假單胞菌屬（Pseudomonas）、擬桿菌屬（Bacteroides）、紅螺菌屬（Rhodospirllum）、節(jié)細菌屬（Arthrobacter）、沙雷氏菌屬（Serratia）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、腸桿菌屬（Enterobacter）、泛生菌屬（Pantoea）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和克雷伯氏菌屬（Klebsiella）等。解磷菌分布受土壤類型、有機質含量、土壤地質等因素的影響[18]，本文從荒漠灌木梭梭根際分離純化獲得8株解有機磷細菌，分屬2個門7個屬，與已分離的荒漠解磷菌種屬類似[19-21]。其中，根瘤菌屬（Rhizobium）有2株，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）有1株，假單胞菌屬（Pseudomonas）有1株，腸桿菌屬（Enterobacter）有1株，泛菌屬（Pantoea）有1株，馬西利亞菌屬（Massilia）有1株，節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）有1株;變形菌門（87.5%）是梭梭根際極優(yōu)勢類群。對分離的菌株進行解有機磷能力測定，植酸酶活性普遍較高，處中上等水平，其中菌株Y29 和B333解有機磷能力最強，植酸酶活分別為（24.21±1.21） μg·mL-1和（20.43±1.02） μg·mL-1，高于已報道菌株的解有機磷能力[19，22-24]。本研究為內蒙古荒漠地區(qū)植物根際解磷菌資源的研究提供了理論依據和實踐基礎，其中篩選所得的2株菌（Y29和B333）在微生物肥料及農藥降解方面具備較高的應用價值，為微生物肥料的開發(fā)利用以及農藥的微生物降解奠定了基礎。

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