劉潔 史紅健 熊雨 范婧瑩 蘇芮 王賢文 吳新正 江志超 何迎春

〔摘要〕 目的 探討黃芩苷（baicalin）對鼻咽癌CNE2細胞增殖及TGF-β1/ERK1/2信號通路的作用。方法 采用CCK8法檢測不同濃度黃芩苷（2.5、5、10、20、40、80 μmol·L-1）、順鉑（4 μg·mL-1）在24、36、48 h對CNE2細胞增殖的作用;細胞成像多功能檢測系統(tǒng)（CytationTM 5）實時監(jiān)測黃芩苷對CNE2增殖數(shù)量的變化;Western blot檢測黃芩苷對CNE2細胞增殖相關蛋白PCNA、Survivin及TGF-β1/ERK1/2信號通路關鍵蛋白TGF-β1、p-ERK1/2的影響。結果 CCK8結果顯示，黃芩苷可抑制CNE2增殖（P<0.05或P<0.01），且隨著濃度升高，抑制作用增強;CytationTM 5監(jiān)測結果顯示，黃芩苷可抑制CNE2細胞數(shù)量增多（P<0.05或P<0.01）;Western blot結果表明，黃芩苷下調了增殖相關蛋白PCNA（P<0.05）、Survivin（P<0.05）及TGF-β1/ERK1/2信號通路關鍵蛋白TGF-β1（P<0.05）、p-ERK1/2（P<0.05）的表達水平。加入TGF-β1（TGF-β1/ERK1/2信號通路激活劑）后，黃芩苷對TGF-β1、p-ERK1/2、PCNA、Survivin的抑制作用降低（P<0.05），同時降低了黃芩苷對CNE2細胞增殖的抑制作用。結論 黃芩苷能夠抑制鼻咽癌CNE2細胞增殖，并通過抑制TGF-β1/ERK1/2信號通路進一步降低下游蛋白PCNA、Survivin的表達發(fā)揮作用。

〔關鍵詞〕 鼻咽癌;黃芩苷;細胞增殖;TGF-β1/ERK1/2信號通路

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.08.004

Baicalin Inhibits Nasopharyngeal Carcinoma Cell Proliferation Via TGF-β1/ERK1/2

Signaling Pathway

LIU Jie1， SHI Hongjian1，2，3， XIONG Yu1， FAN Jingying1，2，3， SU Rui1， WANG Xianwen2，3，4， WU Xinzheng2，3，

JIANG Zhichao2，3，5， HE Yingchun1，2，3*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Hunan Provincial Key Laboratory for the Prevention and Treatment of Ophthalmology and Otolaryngology Diseases with Traditional Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Hunan Provincial Ophthalmology and Otolaryngology Diseases Prevention and Treatment with Traditional Chinese Medicine and Visual Function Protection Engineering and Technological Research Center， Changsha， Hunan 410208， China; 4. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 5. Brain Hospital of Hunan Province， Changsha， Hunan 410005， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effect of baicalin on proliferation and TGF-β1/ERK1/2 signaling pathway of nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells. Methods CCK8 method was used to detect the effect of different concentrations （2.5， 5， 10， 20， 40， 80 μmol·L-1） of baicalin and cisplatin （4 μg·mL-1） on proliferation of CNE2 cells at 24， 36 and 48 hours. Cell imaging multifunctional detection system （CytationTM 5） was used to monitor the changes of baicalin on proliferation of CNE2 cells. Western blot was used to detect the effect of baicalin on PCNA， Survivin and the key proteins of TGF-β1/ERK1/2 signaling pathway TGF-β1， p-ERK1/2 in CNE2 cells. Results CCK8 results showed that baicalin could inhibit proliferation of CNE2 （P<0.05 or P<0.01）， and the inhibition increased with the increasing of concentration. The monitoring results of CytationTM 5 showed that baicalin could inhibit the quantity increasing of CNE2 cells （P<0.05 or P<0.01）. Western blot results showed that baicalin down regulated the protein expression levels of PCNA （P<0.05）， Survivin （P<0.05） and the key proteins of TGF-β1/ERK1/2 signaling pathway TGF-β1 （P<0.05） and p-ERK1/2 （P<0.05）. After adding transforming growth factor-β1 （TGF-β1， TGF-β1/ERK1/2 signal pathway activator）， the inhibitory effect of baicalin on TGF-β1， p-ERK1/2， PCNA and Survivin was decreased （P<0.05）， and the inhibitory effect of baicalin on CNE2 cell proliferation was also decreased. Conclusion Baicalin can inhibit the proliferation of nasopharyngeal carcinoma CNE2 cells， and further reduce the expression of downstream proteins PCNA and Survivin by inhibiting TGF-β1/ERK1/2 signaling pathway.

〔Keywords〕 nasopharyngeal carcinoma; baicalin; cell proliferation; TGF-β1/ERK1/2 signaling pathway

鼻咽癌發(fā)病地域特點明顯，主要在我國南部高發(fā)，由于其發(fā)病部位特殊、放化療敏感度較高，目前臨床依然采用放療為主的聯(lián)合治療[1]。近年來，隨著中醫(yī)藥的深入研究和挖掘，中醫(yī)藥及其活性成分抗腫瘤研究亦取得了較大突破，許多抗腫瘤單體的藥效及作用機制有了實驗驗證，為闡明中醫(yī)藥抗腫瘤機制提供了充分的理論依據(jù)[2]。

黃芩苷（baicalin）是中藥黃芩、半枝蓮等的主要活性成分之一，研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷具有廣泛的抗癌活性[3-4]，在鼻咽癌的研究中，WANG C等[5]研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷可抑制自噬、逆轉鼻咽癌細胞放療抵抗性，李靜等[6]證實，黃芩苷能夠抑制鼻咽癌荷瘤鼠腫瘤發(fā)生發(fā)展，但黃芩苷抑制鼻咽癌增殖的作用機制尚不明確。TGF-β1在大部分腫瘤中表達上調，是腫瘤細胞免疫逃逸的主要調控因子之一[7]，且劉婷等[8]的研究證實，TGF-β1能夠調控鼻咽癌細胞株的增殖和遷移等行為。因此，探討黃芩苷對鼻咽癌細胞的作用和對TGF-β1信號通路的影響及兩者的相關性，可進一步明確黃芩苷抗鼻咽癌的效應及機制，為開發(fā)抗鼻咽癌的中藥單體豐富理論基礎，本實驗擬研究黃芩苷對鼻咽癌CNE2細胞增殖的影響，并檢測其對增殖相關蛋白PCNA、Survivin及TGF-β1/ERK1/2的調控作用，以期為后續(xù)研究提供實驗參考。

1 實驗材料

1.1? 細胞株

人鼻咽癌CNE2細胞（批號：BNCC341794）購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院，由本實驗室傳代培養(yǎng)。

1.2? 主要藥物

黃芩苷（批號：P20A9F59353，純度≥98%）購于上海源葉生物科技有限公司;順鉑（Cisplatin，Cis）（批號：MKCM2435）購于美國Sigma公司;TGF-β1（批號：1218209）購于美國Pepro Tech公司;LY3200882（批號：C24H29N5O3）購于美國Target Mol公司。

1.3? 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基（批號：AE24464298）購自Hyclone公司;胎牛血清（批號：42A0378K）購自Gibco公司;胰蛋白酶消化液（批號：20201113）購自北京索萊寶公司;PCNA 抗體（批號：AH08154078）購自Bioss公司;Survivin 抗體（批號：15）、p-ERK1/2抗體（批號：24）、β-actin 抗體（批號：18）均購自CST公司;TGF-β1 抗體（批號：GR3252552-1）購自Abcam公司。

1.4? 主要儀器

雙人單面凈化工作臺（型號：SW-CJ-2FD，蘇州凈化設備有限公司）;CO2培養(yǎng)箱（型號：HERAcell 150i，賽默飛世爾公司）;全自動酶標分析儀（型號：ELX800，BioTek公司）;細胞成像多功能檢測系統(tǒng)（型號：CytationTM 5，BioTek公司）;雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（型號：Odyssey-CLX，Gene有限公司）。

2 實驗方法

2.1? CCK8法檢測細胞增殖

常規(guī)消化細胞后，調整細胞懸液至5 000個/100 μL，于96孔板中加入100 μL細胞懸液，待細胞貼壁后棄上清液，加入含不同濃度黃芩苷（2.5、5、10、20、40、80 μmol·L-1）、Cis（4 μg·mL-1）的培養(yǎng)液。分別于24、36、48 h后棄上清，加入100 μL CCK8溶液，孵育1.5 h后于450 nm波長測吸光度，并計算細胞相對增殖指數(shù)。

細胞相對增殖指數(shù)=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）

2.2? CytationTM 5監(jiān)測細胞增殖

常規(guī)消化細胞后，調整細胞懸液至5 000個/100 μL，于96孔板中加入100 μL細胞懸液，待細胞貼壁后棄上清液，加入含不同濃度黃芩苷（5、10、20、40 μmol·L-1）、Cis（4 μg·mL-1）的培養(yǎng)液。將96孔板置于CytationTM 5細胞成像多功能檢測系統(tǒng)儀器內，設置6 h拍照1次，總時長48 h。待監(jiān)測結束后，計算細胞數(shù)量，并計算細胞的相對增殖指數(shù)。

2.3? Western blot法檢測蛋白表達水平

根據(jù)CytationTM 5監(jiān)測結果，發(fā)現(xiàn)黃芩苷20、 40 μmol·L-1的濃度抑制增殖效果較好，因此，設置對照組、黃芩苷20 μmol·L-1組、黃芩苷40 μmol·L-1組、Cis 4 μg·mL-1組干預細胞后進行蛋白測定。后續(xù)機制部分研究以TGF-β1作為TGF-β1/ERK1/2信號通路激活劑，LY3200882作為信號通路抑制劑，具體分組如下：對照組、TGF-β1 10 ng·mL-1組、TGF-β1+黃芩苷組、黃芩苷40 μmol·L-1組、LY3200882 10 μmol·L-1組。

藥物處理CNE2細胞36 h后，提取總蛋白，按BCA試劑盒方法定量后，按照60 μg上樣量配置樣品體系。配備10% SDS-PAGE分離膠，待分離膠凝固后加入5%濃縮膠，將樣品加入相應的泳道，先按40 V恒壓電泳，待樣品濃縮好后，逐步增加至90 V或120 V。電泳結束后按照轉膜夾黑色面→海綿→4層濾紙→膠→PVDF膜→4層濾紙→海綿→轉膜夾紅色面的順序放置好后，在轉膜槽倒入轉膜液，按照200 mA、2.5 h的條件在冰上濕轉。轉膜結束后將PVDF膜放入5%的脫脂奶粉室溫下封閉1 h，然后加入稀釋好的一抗溶液，放入4 ℃冰箱孵育過夜。第2天先用TBST洗膜3遍，每次10 min，然后加入相應的熒光二抗室溫避光孵育1.5 h。結束后洗膜3次，每次10 min，最后用雙色紅外熒光成像系統(tǒng)進行掃膜，并用Image Studio軟件分析熒光強度。

2.4? 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 26.0進行分析，計量資料數(shù)據(jù)用“x±s”表示，服從正態(tài)分布且各組間方差齊時，采用單因素方差分析，LSD檢驗，方差不齊時，用Games-Howell（A）檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1? 不同濃度黃芩苷抑制鼻咽癌細胞增殖

與對照組比較，24 h各濃度黃芩苷組，36 h和48 h的黃芩苷20、40、80 μmol·L-1組和Cis 4 μg·mL-1組CNE2細胞增殖指數(shù)降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。與黃芩苷2.5 μmol·L-1組比較，不同時間點黃芩苷（20、40、80 μmol·L-1）組細胞增殖指數(shù)降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。采用CytationTM 5進行實時動態(tài)監(jiān)測進一步驗證黃芩苷對CNE2細胞增殖的抑制作用，細胞在培養(yǎng)48 h后，黃芩苷各濃度組與對照組比較，CNE2細胞增殖明顯被抑制。見表1和圖1。

3.2? 黃芩苷抑制鼻咽癌細胞PCNA、Survivin蛋白表達水平

與對照組相比，黃芩苷40 μmol·L-1組PCNA和Survivin表達水平下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;黃芩苷 20 μmol·L-1組PCNA和Survivin表達水平下降不明顯（P>0.05）。黃芩苷 20 μmol·L-1組和黃芩苷40 μmol·L-1組相比，PCNA 和Survivin表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖2。

3.3? 黃芩苷抑制鼻咽癌細胞TGF-β1/ERK1/2信號通路

與對照組比較，黃芩苷 40 μmol·L-1組TGF-β1和p-ERK1/2的表達水平降低（P<0.05或P<0.01）;但黃芩苷20 μmol·L-1組表達水平降低不明顯（P>0.05）。與黃芩苷20 μmol·L-1組相比，黃芩苷40 μmol·L-1組TGF-β1和p-ERK1/2表達水平降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖3。

3.4? 黃芩苷通過TGF-β1/ERK信號通路抑制CNE2細胞增殖

與對照組相比，TGF-β1 10 ng·mL-1組TGF-β1、p-ERK1/2、PCNA和Survivin的表達水平上升，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;TGF-β1+黃芩苷組TGF-β1和p-ERK1/2表達水平均下調，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;PCNA和Survivin的表達水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;黃芩苷40 μmol·L-1組和LY3200882組p-ERK、PCNA、Survivin的表達水平下降，差異均有統(tǒng)計意義（P<0.05或P<0.01），黃芩苷組TGF-β1下調（P<0.05），但LY3200882組TGF-β1下調不明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與TGF-β1+黃芩苷組比較，黃芩苷40 μmol·L-1組TGF-β1、p-ERK1/2、PCNA表達降低不明顯（P>0.05），Survivin表達水平降低且差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）（圖4A、4B）。CytationTM 5監(jiān)測細胞增殖結果顯示，TGF-β1 10 ng·mL-1組細胞增殖指數(shù)明顯上升，但與對照組比較差異無統(tǒng)計意義（P>0.05）。與TGF-β1+黃芩苷組相比，黃芩苷40 μmol·L-1組細胞增殖指數(shù)降低，但差異無統(tǒng)計學意義（圖4C）。

4 討論

鼻咽癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，治療方案以放化療為主，輔以手術治療，但作用有限且黏膜糜爛、口干、神經損傷等不良反應明顯[9]。而我國傳統(tǒng)醫(yī)藥在鼻咽癌臨床應用中療效顯著，能夠改善鼻咽癌患者的癥狀，提高生活質量[10]。研究[11-12]表明，黃芩苷具有抗腫瘤作用，能夠抑制肺腺癌A549細胞上皮間質化、抑制T細胞淋巴瘤增殖并誘導凋亡。

本研究首先通過CCK8檢測了黃芩苷對鼻咽癌細胞增殖活性的影響，結果表明，不同濃度黃芩苷均可抑制鼻咽癌細胞增殖，且隨著濃度升高，抑制作用更加明顯。同樣，CytationTM 5實時監(jiān)測細胞增殖結果顯示，黃芩苷可抑制CNE2細胞數(shù)量的增長，進一步表明黃芩苷可抑制鼻咽癌細胞增殖。PCNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，課題組前期研究表明，PCNA在鼻咽癌細胞中呈高表達狀態(tài)[13-14]。Survivin是腫瘤標志物之一，與鼻咽癌的分化增殖有關[15-16]。益氣解毒方和三萜類化合物齊墩果酸、茯苓酸、熊果酸及黃芪甲苷均可降低PCNA和Survivin表達水平，抑制鼻咽癌細胞增殖[17-18]，表明藥物通過抑制PCNA和Survivin的活性可以發(fā)揮抗鼻咽癌作用。本實驗結果顯示，黃芩苷能夠下調鼻咽癌細胞中PCNA和Survivin的蛋白表達水平，提示黃芩苷抑制鼻咽癌細胞增殖可能是通過抑制PCNA和Survivin實現(xiàn)的。

TGF-β主要參與細胞增殖、分化及免疫調節(jié)等過程，既可以在正常細胞中參與細胞正常生理過程，當腫瘤發(fā)生時，又可以作為促腫瘤因子推動腫瘤細胞的惡化[19]。TGF-β1是TGF-β超家族中研究得最多的，也是與腫瘤發(fā)生發(fā)展最密切的，因此，本研究通過Western blot檢測了黃芩苷對TGF-β1蛋白水平的影響，結果顯示，黃芩苷組的表達水平與對照組比較明顯下調（P<0.05），說明黃芩苷能夠抑制TGF-β1活性。TGF-β1/ERK1/2途徑屬于非Smad依賴性TGF-β信號通路中的一條，TGF-β1可以激活MAPK/ERK信號通路，其中以ERK1/2為主，引起一系列級聯(lián)反應并產生相應的生物學行為[20]。在本課題組的相關研究中，發(fā)現(xiàn)ERK的活化可促進PCNA、Survivin的蛋白表達水平[11，21]。而黃芩苷能夠降低p-ERK1/2蛋白表達水平，說明黃芩苷對鼻咽癌細胞TGF-β1/ERK1/2信號通路具有抑制作用。在TGF-β1/ERK信號通路被激活后，黃芩苷對TGF-β1、p-ERK1/2、PCNA、Survivin的抑制作用減弱了，同時黃芩苷抑制CNE2細胞增殖的能力被降低，而LY3200882組蛋白表達水平和增殖率均降低，與黃芩苷組作用趨勢基本一致，說明黃芩苷可能作為TGF-β1的抑制藥物發(fā)揮抗鼻咽癌細胞增殖作用，提示黃芩苷抑制CNE2細胞增殖的作用可能是通過調控TGF-β1/ERK1/2信號通路實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究初步證實了黃芩苷能夠抑制鼻咽癌細胞增殖，其部分作用機制是通過抑制TGF-β1/ERK1/2信號通路，進而降低下游蛋白PCNA、Survivin的表達。

參考文獻

[1] 邱前輝，高俊瀟.鼻咽癌外科治療的歷史與現(xiàn)狀及展望[J].中國耳鼻咽喉顱底外科雜志，2020，26（5）：473-477.

[2] 王? 姣，于? 佳，胡萬福，等.臨床常用抗腫瘤中藥的作用機制及抗腫瘤方劑分析[J].癌癥進展，2020，18（9）：884-886，900.

[3] 孔邦彥，魏立彬，郭青龍.黃芩苷的抗腫瘤作用研究進展[J].藥學學報，2021，56（6）：1537-1543.

[4] 劉夢珂，紀濛濛，程? 林，等.黃芩苷抗腫瘤作用機制的研究進展[J].上海交通大學學報（醫(yī)學版），2021，41（2）：246-250.

[5] WANG C， YANG Y L， SUN L N， et al. Baicalin reverses radioresistance in nasopharyngeal carcinoma by downregulating autophagy[J]. Cancer Cell International， 2020， 20（1）： 1-8.

[6] 李? 靜，高? 雪，李玉鳳，等.黃芩苷對鼻咽癌荷瘤鼠抑瘤作用的實驗研究[J].中醫(yī)臨床研究，2017，9（13）：42-43.

[7] 陳蘭玉，胡凱文.基于TGF-β信號通路探討中醫(yī)藥改善腫瘤免疫微環(huán)境的研究進展[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2020，26（11）：1735-1738.

[8] 劉? 婷.N-糖基化抑制通過調控TGFβ/smad通路對鼻咽癌細胞株惡性生物學行為的影響及其機制研究[D].廣州：南方醫(yī)科大學，2017.

[9] 沈? 怡，強萬敏.鼻咽癌病人同步放化療期間癥狀群的調查研究[J].護理研究，2017，31（31）：3962-3966.

[10] 郭良芬，邱寶珊，黃? 姿，等.中西醫(yī)結合治療對鼻咽癌患者生存質量的影響[J].新中醫(yī)，2015，47（7）：112-114.

[11] 王? 林，吳翠蕓，汪賢竹，等.黃芩苷對肺癌A549細胞自噬及上皮間質轉化的影響[J].中國細胞生物學學報，2020，42（11）：1960-1968.

[12] 肖? 丹，鐘? 華，徐? 嵐，等.黃芩苷通過誘導ROS發(fā)生抑制人T細胞淋巴瘤的增殖并促進凋亡[J].腫瘤，2020，40（8）：541-548.

[13] LIU J， HE L， HU J， et al. Isoimperatorin induces apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cells via the MAPK/ERK1/2 signaling pathway[J]. Evidence Based Complementary and Alternative Medicine， 2020， 2020： 2138186.

[14] 周芳亮，胡? 晶，藺? 婷，等.PI3K/Akt信號通路在小檗堿聯(lián)合人參皂苷Rg3誘導鼻咽癌細胞凋亡中的調控作用[J].中國藥理學通報，2021，37（1）：43-52.

[15] 明幫春，張書芳.鼻咽癌組織中survivin蛋白和HIF-1α表達水平及臨床意義[J].解放軍醫(yī)藥雜志，2017，29（6）：62-64，67.

[16] 徐茂林，陳曉華，孫? 波.缺氧誘導因子-1α、生長素基因沉默對CNE-2鼻咽癌細胞放療及凋亡敏感性的影響[J].中國免疫學雜志，2019，35（18）：2249-2252，2257.

[17] 劉? 潔，胡? 晶，戴? 娜，等.益氣解毒方主要三萜類化合物抑制鼻咽癌CNE2細胞增殖效應的比較[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2019，

39（11）：1315-1320.

[18] 胡? 晶，劉? 潔，徐冰雁，等.益氣解毒方對鼻咽癌CNE2細胞增殖的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2019，39（8）：943-947.

[19] 胡? 晶，劉? 潔，徐冰雁，等.MAPK/ERK信號通路在益氣解毒方水提物誘導鼻咽癌細胞凋亡中的作用[J].中國藥理學通報，2019，

35（11）：1613-1621.

[20] 陶? 濤，汪國文，李其才，等.人參皂苷Rg3通過TGF-β1/ERK信號通路調控原位荷瘤人肺癌裸鼠的淋巴管生成的機制[J].中國比較醫(yī)學雜志，2019，29（11）：34-40.

[21] ZHOU F L， HU J， DAI N， et al. Berberine and ginsenoside Rg3 act synergistically via the MAPK/ERK pathway in nasophary?

ngeal carcinoma cells[J]. Journal of Functional Foods， 2020， 66：103802.