石晨，劉向榮,2，胡雪華

(1.西安科技大學 化學與化工學院,陜西 西安 710054；2.自然資源部煤炭資源勘察與綜合利用重點實驗室，陜西 西安 710021)

我國煤炭儲量豐富，特別是風化煤和褐煤[1-2]。但褐煤在燃燒過程中產(chǎn)生NOx，SO2和粉塵等[3-5]，容易引起環(huán)境污染問題。因此，需要尋找一條綠色轉化的新出路，而煤的微生物轉化技術是煤炭清潔利用的有效途徑之一[6-8]。20世紀初，F(xiàn)akoussa[9]和Cohen等[10]發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬、擔子菌和白腐菌等多種菌種能夠降解褐煤。Baylond等[11]研究發(fā)現(xiàn)，與真菌相比，細菌具有繁殖能力強、轉化率高、操作簡便等優(yōu)點。但是，由于煤與菌種的復雜性和多樣性，導致煤的微生物降解實驗需要深入的探究。本文選擇友好戈登氏菌降解內(nèi)蒙古白音華褐煤，旨在優(yōu)化降解工藝條件，探討降解過程和分析產(chǎn)物組成。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

內(nèi)蒙白音華褐煤；濃硝酸、蛋白胨、酵母粉、MgSO4·H2O和瓊脂等均為分析純；友好戈登氏菌，購買于中國微生物菌種保藏管理中心(CICC)，編號為CICC 20664。

CTDG-200875 密封對輥破碎機；XMB-70A型棒磨機；PS-200振篩機；SW-CJ-1FD超凈工作臺；BL-50A立式壓力蒸汽滅器；BC-360生化培養(yǎng)箱；HZQ-F100全溫振蕩培養(yǎng)箱；Thermo Scientific傅里葉變換紅外光譜儀；Mini Flex600 X射線衍射儀；Mettler-Toledo TG-DSC1 HT型熱重分析儀；7890A/5975C氣相-質譜聯(lián)用分析儀等。

1.2 煤樣的預處理

煤樣采自內(nèi)蒙白音華煤礦，經(jīng)過粉碎，篩分，選擇粒徑為0.125～0.250 mm的原煤進行硝酸預處理，用8 mol/L的硝酸浸泡24 h。浸泡結束后，用蒸餾水進行洗滌、過濾，直至pH≈7。將煤樣裝入燒杯，使用透氣膜和報紙封口，滅菌15 min。

1.3 菌種培養(yǎng)

友好戈登氏菌，培養(yǎng)基采用CICC提供的配方，組成為：蛋白胨10 g，酵母粉2 g，MgSO4·H2O 1 g，瓊脂 20 g，蒸餾水1 L，pH=7。取斜面活化后的菌種，接于200 mL的液體培養(yǎng)基中，在溫度為30 ℃，搖床轉速為160 r/min進行培養(yǎng)，時間為3 d，得到擴大培養(yǎng)液。

1.4 微生物降解實驗

取0.3 g煤樣和50 mL液體培養(yǎng)基分別放入BL-50A滅菌鍋中，121 ℃，滅菌15 min。與10 mL擴大培養(yǎng)液混合放入HZQ-F100搖床中，在溫度30 ℃， 搖床轉速為160 r/min中培養(yǎng)。實驗結束后，離心(9 000 r/min，20 min)，收集固相產(chǎn)物(剩煤)和液相產(chǎn)物。用蒸餾水對固相產(chǎn)物(剩煤)進行清洗，直至固相產(chǎn)物(剩煤)中無菌體殘留，烘干(90 ℃，12 h)備用。

1.5 降解產(chǎn)物分析與表征

1.5.1 固相產(chǎn)物 準確稱取1.5 mg干燥后的固相產(chǎn)物(剩煤)與200 mg的KBr混合，制成薄片，在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)，分辨率4 cm-1，用Thermo Scientific 傅里葉變換紅外光譜儀進行掃描。采用Mini Flex600 X-射線衍射儀，對固相產(chǎn)物(剩煤)進行XRD分析，掃描速度為2(°)/min，掃描范圍為10～80°，Cu KaX衍射源，工作電壓40 kV，工作電流200 mV。采用Mettler-Toledo TG-DSC1 HT型熱重分析儀對固相產(chǎn)物(剩煤)進行熱重實驗。原煤和氧化煤的分析方法與固相產(chǎn)物(剩煤)相同。

1.5.2 液相產(chǎn)物 將最佳工藝條件下得到的黑色液相產(chǎn)物，使用不同極性的萃取劑進行萃取。萃取劑的極性由小到大的順序為四氯化碳<苯<丙酮<甲醇。萃取液利用7890A/5975 C型氣相色譜-質譜聯(lián)用儀進行測定。

1.6 降解率的測定和計算

降解過程的測定指標有2種[12]。

1.6.1 降解率 將降解完的煤液，過濾，烘干稱重為m和起始加入煤質量m0的差值除以起始煤的質量m0，為降解率η。見公式(1)。

(1)

其中,η為降解率；m0為起始加入煤的質量，g；m為固相產(chǎn)物(剩煤)的質量，g。

1.6.2 吸光度 石開儀等[13]通過測量液相產(chǎn)物中450 nm處的吸光度，用來評估微生物降解效果，并且發(fā)現(xiàn)A450值與降解率呈現(xiàn)正相關。

2 結果與討論

2.1 煤樣的預處理

原煤、氧化煤(8 mol/L)和固相產(chǎn)物(剩煤)的工業(yè)分析與元素分析見表1。

表1 煤樣工業(yè)分析和元素分析Table 1 Ultimate and proximate analysis of testing coal sample

由表1可知，原煤的揮發(fā)分為48.64%，碳含量為58.70%，氧含量為31.47%，屬于褐煤。硝酸預處理后，碳含量降低，氧含量升高，發(fā)生了氧化反應。石開儀[14]和尹蘇東等[15-16]研究發(fā)現(xiàn)煤經(jīng)硝酸氧化后，灰分含量降低，揮發(fā)分升高，孔徑增大。此外，硝酸與煤中含芳環(huán)基團之間發(fā)生了化學反應，如芳香環(huán)的氧化和芳香環(huán)側鏈氧化成酯、醛、酮等物質。這些結構的變化有利于生物降解，增加降解率[17-18]。

微生物作用后，氧化煤中的氧和氮含量下降?？赡苁怯押酶甑鞘暇置诔鰜淼幕钚晕镔|與氧化煤中的羧基和氨基發(fā)生反應，生成小分子化合物，導致其含量下降[8]。

2.2 煤的微生物降解實驗

2.2.1 煤漿濃度對降解效果的影響 由圖1可知，隨著煤漿濃度的增加，友好戈登氏菌對白音華氧化煤呈現(xiàn)先增加再減少的趨勢，當煤漿濃度為0.5 g/50 mL 培養(yǎng)基時，吸光度A450值最大為1.413。原因可能是當煤漿濃度增加時，友好戈登氏菌的生長受到抑制，繁殖空間有限，不能更好利用白音華氧化煤作為碳源，因此最佳煤漿濃度為0.5 g/50 mL 培養(yǎng)基。

圖1 煤漿濃度對降解效果的影響Fig.1 Effect of concentration of coal slurry on coal biodegradation

2.2.2 菌液用量對降解效果的影響 由圖2可知，當菌液用量為7 mL/50 mL培養(yǎng)基時，吸光度A450值最大為0.941，此后繼續(xù)增加菌液用量，降解效果變化不大。由此可見，當菌液用量小于7 mL/50 mL培養(yǎng)基時，友好戈登氏菌對生物降解效果有顯著的影響，當菌液用量大于7 mL/50 mL培養(yǎng)基時，菌液用量對生物降解效果的影響不再顯著。分析原因，細菌受到生長環(huán)境的限制，當細菌個數(shù)到達一定數(shù)量時，繼續(xù)增加菌液用量，細菌數(shù)量不能再增加，所以生物降解效果也不能繼續(xù)增強。

圖2 菌液用量對降解效果的影響Fig.2 Effect of inoculum amount on coal biodegradation

2.2.3 降解時間對降解效果的影響 由圖3可知，降解時間對降解效果的影響分為2個階段，分別是快速降解期和平穩(wěn)期。當降解時間小于21 d時，降解效果受時間的影響比較明顯。當降解時間超出21 d時，降解時間對降解效果的影響較小，說明友好戈登氏菌對白音華氧化煤降解達到最大值。分析原因可能是當降解時間增加到21 d以后，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分已經(jīng)被微生物消耗殆盡，菌種死亡。最佳降解時間為21 d。

圖3 降解時間對降解效果的影響Fig.3 Effect of degradation time on coal biodegradation

2.2.4 培養(yǎng)方式對降解效果的影響 由圖4可知，搖床培養(yǎng)的吸光度明顯高于水浴培養(yǎng)和靜置培養(yǎng)，因此，選擇搖床培養(yǎng)為最佳培養(yǎng)方式。分析原因，其一是搖瓶培養(yǎng)能夠增加培養(yǎng)基的溶氧率，提高細菌活性，促進煤的微生物降解；其二是搖瓶培養(yǎng)能夠使白音華氧化煤與降解活性物質充分接觸，從而獲得搖瓶培養(yǎng)降解效果高于靜置培養(yǎng)。

圖4 培養(yǎng)方式對降解效果的影響Fig.4 Effect of cultivation ways on coal biodegradation

2.2.5 正交實驗 在單因素分析基礎上，通過正交實驗得出最佳工藝條件。正交實驗的因素與水平見表2，選擇搖床培養(yǎng)方式，進行煤的微生物降解實驗，結果見表3。

表2 正交實驗的因素與水平Table 2 Factors and levels of the orthogonal experiments

由表3可知，3個因素對微生物降解效果影響的權重大小為A>C>B，即煤漿濃度對降解效果影響最大，降解時間次之，菌液用量影響最小。煤漿濃度對微生物降解效果影響最大可能原因是，當其它條件一定時，煤漿濃度越大時，菌種的生長容易受到抑制，微生物分泌的活性物質降低，導致降解效果降低。最佳工藝條件為A3B3C2，即煤漿濃度為0.6 g/50 mL，菌液用量為9 mL/50 mL培養(yǎng)基，降解時間為21 d，此時降解效果最好，A450值為1.555，降解率為57%。

表3 友好戈登氏菌降解白音華 氧化煤的正交實驗結果Table 3 Orthogonal experiment results of Baiyinhua oxidized coal degradation by Gordonia amicalis

2.3 產(chǎn)物分析

2.3.1 FTIR分析 圖5為原煤、氧化煤與固相產(chǎn)物(剩煤)的紅外光譜。

圖5 不同煤樣的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectra of different coal samples

2.3.2 TG-DTG分析 圖6～圖8為原煤、氧化煤和固相產(chǎn)物(剩煤)的熱重曲線。

圖6 原煤的熱重曲線Fig.6 TG-DTG curves of raw coal

圖7 氧化煤的熱重曲線圖Fig.7 TG-DTG curves of oxidized coal

圖8 固相產(chǎn)物(剩煤)的熱重曲線圖Fig.8 TG-DTG curves of residual coal

由圖6～圖8可知，原煤有兩個失重階段，而氧化煤和固相產(chǎn)物(剩煤)有3個失重階段。3種煤樣的第1個失重階段相似，溫度范圍為30～150 ℃，主要是吸附水和吸附氣體(CH4、CO2、N2)的脫除，在30～100 ℃之間主要是以物理吸附為主的體相水和毛細水(煤顆粒表面和大孔中的水分)的脫除，在100～150 ℃之間主要是脫除多層水和單層水(吸附或凝聚在煤顆粒內(nèi)部的中孔或微孔中的水分)。原煤的第2失重階段的溫度范圍為151～800 ℃，該階段主要是煤的軟化熔融和熱分解階段，氧化煤和固相產(chǎn)物(剩煤)的第2熱分解階段的溫度范圍為150～400 ℃，該階段主要是煤的軟化熔融[21]。氧化煤和殘煤的第3失重階段溫度范圍為401～800 ℃，該階段是主要的熱分解階段，發(fā)生了劇烈的化學反應，煤的物理、化學結構發(fā)生破壞，大量揮發(fā)分氣體析出(氣態(tài)烴、CO2和CO)，并有焦油產(chǎn)生，煤變成半焦[22]。

硝酸氧化后，氧化煤的第2段失重階段的溫度降低，原煤、氧化煤和固相產(chǎn)物(剩煤)的熱失重率由大到小的順序為氧化煤>固相產(chǎn)物(剩煤)>原煤，熱穩(wěn)定性為原煤>固相產(chǎn)物(剩煤)>氧化煤。結果表明，經(jīng)硝酸氧化后的煤樣結構變得松散，熱穩(wěn)定性降低。與氧化煤相比，固相產(chǎn)物(剩煤)的第2階段(TP2)和第3階段(TP3)的熱失重峰溫值均升高，說明細菌降解了氧化煤中結構較松散的部分，煤樣的熱穩(wěn)定性提高。

2.3.3 XRD分析 圖9為原煤、氧化煤和固相產(chǎn)物(剩煤)的XRD圖，表4為3種煤樣的XRD晶格參數(shù)。

圖9 不同煤樣的XRD圖譜Fig.9 XRD of different coal samples

表4 不同煤樣的XRD晶格參數(shù)Table 4 XRD lattice parameters of different coal samples

由圖9可知，原煤、氧化煤和固相產(chǎn)物(剩煤)的XRD譜峰相似，峰型變化呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。由于褐煤中芳香層片間是以交聯(lián)鍵連接，并且在任意方向均可取向。因此，造成了褐煤的多孔立體結構。由表4可知，煤樣的芳香層間距d002呈現(xiàn)增加趨勢，微晶高度Lc和芳香層數(shù)Nave呈現(xiàn)減小的趨勢，而微晶直徑La在進行硝酸處理后有所上升，微生物降解后又逐漸下降。

硝酸氧化后使得白音華原煤大分子結構遭到破壞，空間的排列逐漸變得不規(guī)則，煤中的芳香環(huán)打開，在斷開處引入羧基、羥基和氨基等基團，并且在空間形成立體結構，這些三維立體結構的間距要比芳香環(huán)的鍵間距大，因此，導致芳香層間距d002增加，微晶高度Lc和芳香層數(shù)Nave減小[23]。

微生物降解后，使得氧化煤中的芳香層片數(shù)和堆砌高度減少，表明微生物對白音華氧化煤有較好的降解效果，分析原因可能是微生物分泌出來的活性物質降解了氧化煤中的芳香環(huán)、脂肪族物質和側鏈烷烴，使氧化煤大分子排列更加疏松[24-25]，增加了煤大分子重構的可能性，在空間上降低了芳香層堆疊的數(shù)量，減少了芳香層之間的垂直距離，從而使芳香層間距d002增加，微晶直徑La，微晶高度Lc和芳香層數(shù)Nave減小，也進一步說明固相產(chǎn)物(剩煤)穩(wěn)定性更高這與熱重分析結果一致。

2.3.4 GC-MS分析 液相產(chǎn)物分別用四氯化碳、苯、丙酮和甲醇進行萃取，總離子色譜依次見圖10～圖13，降解液相產(chǎn)物中有機化合物的組成見表5。

表5 降解液相產(chǎn)物中有機化合物的組成Table 5 Compositions of organic compounds in the biodegradation liquid products

圖10 四氯化碳萃取液相產(chǎn)物總離子色譜圖Fig.10 Total ion chromatograms of the liquid products extracted by carbon tetrachloride

由圖10可知，四氯化碳萃取液相產(chǎn)物總共檢測到45種化合物，相對分子量在72～278。其中烷烴類含量為56.47%，羧酸類含量為26.56%，酯類含量為10.00%，醛酮類含量為6.97%。四氯化碳的萃取物中主要含有烷烴類物質。

由圖11可知，苯萃取液相產(chǎn)物總共檢測出16種化合物，相對分子量在96～266。其中烷烴類含量為54.52%，羧酸類含量為22.54%，酯類含量為19.12%，萃取物中主要含有烷烴類物質。

圖11 苯萃取液相產(chǎn)物總離子色譜圖Fig.11 Total ion chromatograms of the liquid products extracted by benzene

由圖12可知，丙酮萃取液相產(chǎn)物總共檢測到74種化合物，相對分子量在100～298。其中胺類含量為29.08%，烷烴類含量為28.85%，羧酸類含量為23.15%，醇類為12.96%。

圖12 丙酮萃取降解產(chǎn)物總離子色譜圖Fig.12 Total ion chromatograms of the liquid products extracted by acetone

由圖13可知，甲醇萃取液相產(chǎn)物總共檢測出36種化合物，相對分子量在73～367。其中醛酮類含量為61.80%，烷烴類含量為23.41%，胺類含量為11.05%，羧酸類含量為3.74%。綜上所述，友好戈登氏菌對白音華氧化煤的降解產(chǎn)物中主要含有烷烴類、羧酸類、醛酮類、胺類、酯類和醇類等小分子物質，其相對分子量在70～370。

圖13 甲醇萃取液相產(chǎn)物總離子色譜圖Fig.13 Total ion chromatograms of the liquid products extracted by methanol

3 結論

(1)友好戈登氏菌降解內(nèi)蒙古白音華褐煤的最佳工藝條件為：煤漿濃度0.6 g/50 mL培養(yǎng)基，菌液用量9 mL/50 mL培養(yǎng)基，降解時間21 d，培養(yǎng)方式為搖床培養(yǎng)，此時降解率最高為57%。影響微生物降解效果的順序為煤漿濃度>降解時間>菌液用量。

(2) 硝酸處理后，氧化煤中羧基和硝基振動峰增加，芳香環(huán)的骨架振動減弱，芳香層間距增加，微晶高度和芳香層數(shù)減小，熱穩(wěn)定性降低，熱解活性增加，更有利于生物降解。

(3) 微生物降解后，固相產(chǎn)物(剩煤)中芳香環(huán)、脂肪烴、羰基、醚鍵和硝基的吸收峰減弱甚至是消失，芳香層間距增加，微晶直徑，微晶高度和芳香層數(shù)減小，熱穩(wěn)定性增加，熱解活性減弱，說明友好戈登氏菌破壞了白音華氧化煤的大分子結構。

(4) 微生物降解液相產(chǎn)物中含有烷烴類、酯類、醇類、醛酮類、羧酸類和胺類等小分子物質，相對分子量在70～370。