石晨，劉向榮,2，胡雪華

(1.西安科技大學 化學與化工學院,陜西 西安 710054；2.自然資源部煤炭資源勘察與綜合利用重點實驗室，陜西 西安 710021)

我國煤炭儲量豐富，特別是風化煤和褐煤[1-2]。但褐煤在燃燒過程中產(chǎn)生NOx，SO2和粉塵等[3-5]，容易引起環(huán)境污染問題。因此，需要尋找一條綠色轉(zhuǎn)化的新出路，而煤的微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)是煤炭清潔利用的有效途徑之一[6-8]。20世紀初，F(xiàn)akoussa[9]和Cohen等[10]發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬、擔子菌和白腐菌等多種菌種能夠降解褐煤。Baylond等[11]研究發(fā)現(xiàn)，與真菌相比，細菌具有繁殖能力強、轉(zhuǎn)化率高、操作簡便等優(yōu)點。但是，由于煤與菌種的復雜性和多樣性，導致煤的微生物降解實驗需要深入的探究。本文選擇友好戈登氏菌降解內(nèi)蒙古白音華褐煤，旨在優(yōu)化降解工藝條件，探討降解過程和分析產(chǎn)物組成。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

內(nèi)蒙白音華褐煤；濃硝酸、蛋白胨、酵母粉、MgSO4·H2O和瓊脂等均為分析純；友好戈登氏菌，購買于中國微生物菌種保藏管理中心(CICC)，編號為CICC 20664。

CTDG-200875 密封對輥破碎機；XMB-70A型棒磨機；PS-200振篩機；SW-CJ-1FD超凈工作臺；BL-50A立式壓力蒸汽滅器；BC-360生化培養(yǎng)箱；HZQ-F100全溫振蕩培養(yǎng)箱；Thermo Scientific傅里葉變換紅外光譜儀；Mini Flex600 X射線衍射儀；Mettler-Toledo TG-DSC1 HT型熱重分析儀；7890A/5975C氣相-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀等。

1.2 煤樣的預處理

煤樣采自內(nèi)蒙白音華煤礦，經(jīng)過粉碎，篩分，選擇粒徑為0.125～0.250 mm的原煤進行硝酸預處理，用8 mol/L的硝酸浸泡24 h。浸泡結(jié)束后，用蒸餾水進行洗滌、過濾，直至pH≈7。將煤樣裝入燒杯，使用透氣膜和報紙封口，滅菌15 min。

1.3 菌種培養(yǎng)

友好戈登氏菌，培養(yǎng)基采用CICC提供的配方，組成為：蛋白胨10 g，酵母粉2 g，MgSO4·H2O 1 g，瓊脂 20 g，蒸餾水1 L，pH=7。取斜面活化后的菌種，接于200 mL的液體培養(yǎng)基中，在溫度為30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min進行培養(yǎng)，時間為3 d，得到擴大培養(yǎng)液。

1.4 微生物降解實驗

取0.3 g煤樣和50 mL液體培養(yǎng)基分別放入BL-50A滅菌鍋中，121 ℃，滅菌15 min。與10 mL擴大培養(yǎng)液混合放入HZQ-F100搖床中，在溫度30 ℃， 搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min中培養(yǎng)。實驗結(jié)束后，離心(9 000 r/min，20 min)，收集固相產(chǎn)物(剩煤)和液相產(chǎn)物。用蒸餾水對固相產(chǎn)物(剩煤)進行清洗，直至固相產(chǎn)物(剩煤)中無菌體殘留，烘干(90 ℃，12 h)備用。

1.5 降解產(chǎn)物分析與表征

1.5.1 固相產(chǎn)物 準確稱取1.5 mg干燥后的固相產(chǎn)物(剩煤)與200 mg的KBr混合，制成薄片，在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)，分辨率4 cm-1，用Thermo Scientific 傅里葉變換紅外光譜儀進行掃描。采用Mini Flex600 X-射線衍射儀，對固相產(chǎn)物(剩煤)進行XRD分析，掃描速度為2(°)/min，掃描范圍為10～80°，Cu KaX衍射源，工作電壓40 kV，工作電流200 mV。采用Mettler-Toledo TG-DSC1 HT型熱重分析儀對固相產(chǎn)物(剩煤)進行熱重實驗。原煤和氧化煤的分析方法與固相產(chǎn)物(剩煤)相同。

1.5.2 液相產(chǎn)物 將最佳工藝條件下得到的黑色液相產(chǎn)物，使用不同極性的萃取劑進行萃取。萃取劑的極性由小到大的順序為四氯化碳<苯<丙酮<甲醇。萃取液利用7890A/5975 C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行測定。

1.6 降解率的測定和計算

降解過程的測定指標有2種[12]。

1.6.1 降解率 將降解完的煤液，過濾，烘干稱重為m和起始加入煤質(zhì)量m0的差值除以起始煤的質(zhì)量m0，為降解率η。見公式(1)。

(1)

其中,η為降解率；m0為起始加入煤的質(zhì)量，g；m為固相產(chǎn)物(剩煤)的質(zhì)量，g。

1.6.2 吸光度 石開儀等[13]通過測量液相產(chǎn)物中450 nm處的吸光度，用來評估微生物降解效果，并且發(fā)現(xiàn)A450值與降解率呈現(xiàn)正相關(guān)。

2 結(jié)果與討論

2.1 煤樣的預處理

原煤、氧化煤(8 mol/L)和固相產(chǎn)物(剩煤)的工業(yè)分析與元素分析見表1。

表1 煤樣工業(yè)分析和元素分析Table 1 Ultimate and proximate analysis of testing coal sample

由表1可知，原煤的揮發(fā)分為48.64%，碳含量為58.70%，氧含量為31.47%，屬于褐煤。硝酸預處理后，碳含量降低，氧含量升高，發(fā)生了氧化反應(yīng)。石開儀[14]和尹蘇東等[15-16]研究發(fā)現(xiàn)煤經(jīng)硝酸氧化后，灰分含量降低，揮發(fā)分升高，孔徑增大。此外，硝酸與煤中含芳環(huán)基團之間發(fā)生了化學反應(yīng)，如芳香環(huán)的氧化和芳香環(huán)側(cè)鏈氧化成酯、醛、酮等物質(zhì)。這些結(jié)構(gòu)的變化有利于生物降解，增加降解率[17-18]。

微生物作用后，氧化煤中的氧和氮含量下降?？赡苁怯押酶甑鞘暇置诔鰜淼幕钚晕镔|(zhì)與氧化煤中的羧基和氨基發(fā)生反應(yīng)，生成小分子化合物，導致其含量下降[8]。

2.2 煤的微生物降解實驗

2.2.1 煤漿濃度對降解效果的影響 由圖1可知，隨著煤漿濃度的增加，友好戈登氏菌對白音華氧化煤呈現(xiàn)先增加再減少的趨勢，當煤漿濃度為0.5 g/50 mL 培養(yǎng)基時，吸光度A450值最大為1.413。原因可能是當煤漿濃度增加時，友好戈登氏菌的生長受到抑制，繁殖空間有限，不能更好利用白音華氧化煤作為碳源，因此最佳煤漿濃度為0.5 g/50 mL 培養(yǎng)基。

圖1 煤漿濃度對降解效果的影響Fig.1 Effect of concentration of coal slurry on coal biodegradation

2.2.2 菌液用量對降解效果的影響 由圖2可知，當菌液用量為7 mL/50 mL培養(yǎng)基時，吸光度A450值最大為0.941，此后繼續(xù)增加菌液用量，降解效果變化不大。由此可見，當菌液用量小于7 mL/50 mL培養(yǎng)基時，友好戈登氏菌對生物降解效果有顯著的影響，當菌液用量大于7 mL/50 mL培養(yǎng)基時，菌液用量對生物降解效果的影響不再顯著。分析原因，細菌受到生長環(huán)境的限制，當細菌個數(shù)到達一定數(shù)量時，繼續(xù)增加菌液用量，細菌數(shù)量不能再增加，所以生物降解效果也不能繼續(xù)增強。

圖2 菌液用量對降解效果的影響Fig.2 Effect of inoculum amount on coal biodegradation

2.2.3 降解時間對降解效果的影響 由圖3可知，降解時間對降解效果的影響分為2個階段，分別是快速降解期和平穩(wěn)期。當降解時間小于21 d時，降解效果受時間的影響比較明顯。當降解時間超出21 d時，降解時間對降解效果的影響較小，說明友好戈登氏菌對白音華氧化煤降解達到最大值。分析原因可能是當降解時間增加到21 d以后，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分已經(jīng)被微生物消耗殆盡，菌種死亡。最佳降解時間為21 d。

圖3 降解時間對降解效果的影響Fig.3 Effect of degradation time on coal biodegradation

2.2.4 培養(yǎng)方式對降解效果的影響 由圖4可知，搖床培養(yǎng)的吸光度明顯高于水浴培養(yǎng)和靜置培養(yǎng)，因此，選擇搖床培養(yǎng)為最佳培養(yǎng)方式。分析原因，其一是搖瓶培養(yǎng)能夠增加培養(yǎng)基的溶氧率，提高細菌活性，促進煤的微生物降解；其二是搖瓶培養(yǎng)能夠使白音華氧化煤與降解活性物質(zhì)充分接觸，從而獲得搖瓶培養(yǎng)降解效果高于靜置培養(yǎng)。

圖4 培養(yǎng)方式對降解效果的影響Fig.4 Effect of cultivation ways on coal biodegradation

2.2.5 正交實驗 在單因素分析基礎(chǔ)上，通過正交實驗得出最佳工藝條件。正交實驗的因素與水平見表2，選擇搖床培養(yǎng)方式，進行煤的微生物降解實驗，結(jié)果見表3。

表2 正交實驗的因素與水平Table 2 Factors and levels of the orthogonal experiments

由表3可知，3個因素對微生物降解效果影響的權(quán)重大小為A>C>B，即煤漿濃度對降解效果影響最大，降解時間次之，菌液用量影響最小。煤漿濃度對微生物降解效果影響最大可能原因是，當其它條件一定時，煤漿濃度越大時，菌種的生長容易受到抑制，微生物分泌的活性物質(zhì)降低，導致降解效果降低。最佳工藝條件為A3B3C2，即煤漿濃度為0.6 g/50 mL，菌液用量為9 mL/50 mL培養(yǎng)基，降解時間為21 d，此時降解效果最好，A450值為1.555，降解率為57%。

表3 友好戈登氏菌降解白音華 氧化煤的正交實驗結(jié)果Table 3 Orthogonal experiment results of Baiyinhua oxidized coal degradation by Gordonia amicalis

2.3 產(chǎn)物分析

2.3.1 FTIR分析 圖5為原煤、氧化煤與固相產(chǎn)物(剩煤)的紅外光譜。

圖5 不同煤樣的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectra of different coal samples

2.3.2 TG-DTG分析 圖6～圖8為原煤、氧化煤和固相產(chǎn)物(剩煤)的熱重曲線。

圖6 原煤的熱重曲線Fig.6 TG-DTG curves of raw coal

圖7 氧化煤的熱重曲線圖Fig.7 TG-DTG curves of oxidized coal

圖8 固相產(chǎn)物(剩煤)的熱重曲線圖Fig.8 TG-DTG curves of residual coal

由圖6～圖8可知，原煤有兩個失重階段，而氧化煤和固相產(chǎn)物(剩煤)有3個失重階段。3種煤樣的第1個失重階段相似，溫度范圍為30～150 ℃，主要是吸附水和吸附氣體(CH4、CO2、N2)的脫除，在30～100 ℃之間主要是以物理吸附為主的體相水和毛細水(煤顆粒表面和大孔中的水分)的脫除，在100～150 ℃之間主要是脫除多層水和單層水(吸附或凝聚在煤顆粒內(nèi)部的中孔或微孔中的水分)。原煤的第2失重階段的溫度范圍為151～800 ℃，該階段主要是煤的軟化熔融和熱分解階段，氧化煤和固相產(chǎn)物(剩煤)的第2熱分解階段的溫度范圍為150～400 ℃，該階段主要是煤的軟化熔融[21]。氧化煤和殘煤的第3失重階段溫度范圍為401～800 ℃，該階段是主要的熱分解階段，發(fā)生了劇烈的化學反應(yīng)，煤的物理、化學結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，大量揮發(fā)分氣體析出(氣態(tài)烴、CO2和CO)，并有焦油產(chǎn)生，煤變成半焦[22]。

硝酸氧化后，氧化煤的第2段失重階段的溫度降低，原煤、氧化煤和固相產(chǎn)物(剩煤)的熱失重率由大到小的順序為氧化煤>固相產(chǎn)物(剩煤)>原煤，熱穩(wěn)定性為原煤>固相產(chǎn)物(剩煤)>氧化煤。結(jié)果表明，經(jīng)硝酸氧化后的煤樣結(jié)構(gòu)變得松散，熱穩(wěn)定性降低。與氧化煤相比，固相產(chǎn)物(剩煤)的第2階段(TP2)和第3階段(TP3)的熱失重峰溫值均升高，說明細菌降解了氧化煤中結(jié)構(gòu)較松散的部分，煤樣的熱穩(wěn)定性提高。

2.3.3 XRD分析 圖9為原煤、氧化煤和固相產(chǎn)物(剩煤)的XRD圖，表4為3種煤樣的XRD晶格參數(shù)。

圖9 不同煤樣的XRD圖譜Fig.9 XRD of different coal samples

表4 不同煤樣的XRD晶格參數(shù)Table 4 XRD lattice parameters of different coal samples

由圖9可知，原煤、氧化煤和固相產(chǎn)物(剩煤)的XRD譜峰相似，峰型變化呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。由于褐煤中芳香層片間是以交聯(lián)鍵連接，并且在任意方向均可取向。因此，造成了褐煤的多孔立體結(jié)構(gòu)。由表4可知，煤樣的芳香層間距d002呈現(xiàn)增加趨勢，微晶高度Lc和芳香層數(shù)Nave呈現(xiàn)減小的趨勢，而微晶直徑La在進行硝酸處理后有所上升，微生物降解后又逐漸下降。

硝酸氧化后使得白音華原煤大分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，空間的排列逐漸變得不規(guī)則，煤中的芳香環(huán)打開，在斷開處引入羧基、羥基和氨基等基團，并且在空間形成立體結(jié)構(gòu)，這些三維立體結(jié)構(gòu)的間距要比芳香環(huán)的鍵間距大，因此，導致芳香層間距d002增加，微晶高度Lc和芳香層數(shù)Nave減小[23]。

微生物降解后，使得氧化煤中的芳香層片數(shù)和堆砌高度減少，表明微生物對白音華氧化煤有較好的降解效果，分析原因可能是微生物分泌出來的活性物質(zhì)降解了氧化煤中的芳香環(huán)、脂肪族物質(zhì)和側(cè)鏈烷烴，使氧化煤大分子排列更加疏松[24-25]，增加了煤大分子重構(gòu)的可能性，在空間上降低了芳香層堆疊的數(shù)量，減少了芳香層之間的垂直距離，從而使芳香層間距d002增加，微晶直徑La，微晶高度Lc和芳香層數(shù)Nave減小，也進一步說明固相產(chǎn)物(剩煤)穩(wěn)定性更高這與熱重分析結(jié)果一致。

2.3.4 GC-MS分析 液相產(chǎn)物分別用四氯化碳、苯、丙酮和甲醇進行萃取，總離子色譜依次見圖10～圖13，降解液相產(chǎn)物中有機化合物的組成見表5。

表5 降解液相產(chǎn)物中有機化合物的組成Table 5 Compositions of organic compounds in the biodegradation liquid products

圖10 四氯化碳萃取液相產(chǎn)物總離子色譜圖Fig.10 Total ion chromatograms of the liquid products extracted by carbon tetrachloride

由圖10可知，四氯化碳萃取液相產(chǎn)物總共檢測到45種化合物，相對分子量在72～278。其中烷烴類含量為56.47%，羧酸類含量為26.56%，酯類含量為10.00%，醛酮類含量為6.97%。四氯化碳的萃取物中主要含有烷烴類物質(zhì)。

由圖11可知，苯萃取液相產(chǎn)物總共檢測出16種化合物，相對分子量在96～266。其中烷烴類含量為54.52%，羧酸類含量為22.54%，酯類含量為19.12%，萃取物中主要含有烷烴類物質(zhì)。

圖11 苯萃取液相產(chǎn)物總離子色譜圖Fig.11 Total ion chromatograms of the liquid products extracted by benzene

由圖12可知，丙酮萃取液相產(chǎn)物總共檢測到74種化合物，相對分子量在100～298。其中胺類含量為29.08%，烷烴類含量為28.85%，羧酸類含量為23.15%，醇類為12.96%。

圖12 丙酮萃取降解產(chǎn)物總離子色譜圖Fig.12 Total ion chromatograms of the liquid products extracted by acetone

由圖13可知，甲醇萃取液相產(chǎn)物總共檢測出36種化合物，相對分子量在73～367。其中醛酮類含量為61.80%，烷烴類含量為23.41%，胺類含量為11.05%，羧酸類含量為3.74%。綜上所述，友好戈登氏菌對白音華氧化煤的降解產(chǎn)物中主要含有烷烴類、羧酸類、醛酮類、胺類、酯類和醇類等小分子物質(zhì)，其相對分子量在70～370。

圖13 甲醇萃取液相產(chǎn)物總離子色譜圖Fig.13 Total ion chromatograms of the liquid products extracted by methanol

3 結(jié)論

(1)友好戈登氏菌降解內(nèi)蒙古白音華褐煤的最佳工藝條件為：煤漿濃度0.6 g/50 mL培養(yǎng)基，菌液用量9 mL/50 mL培養(yǎng)基，降解時間21 d，培養(yǎng)方式為搖床培養(yǎng)，此時降解率最高為57%。影響微生物降解效果的順序為煤漿濃度>降解時間>菌液用量。

(2) 硝酸處理后，氧化煤中羧基和硝基振動峰增加，芳香環(huán)的骨架振動減弱，芳香層間距增加，微晶高度和芳香層數(shù)減小，熱穩(wěn)定性降低，熱解活性增加，更有利于生物降解。

(3) 微生物降解后，固相產(chǎn)物(剩煤)中芳香環(huán)、脂肪烴、羰基、醚鍵和硝基的吸收峰減弱甚至是消失，芳香層間距增加，微晶直徑，微晶高度和芳香層數(shù)減小，熱穩(wěn)定性增加，熱解活性減弱，說明友好戈登氏菌破壞了白音華氧化煤的大分子結(jié)構(gòu)。

(4) 微生物降解液相產(chǎn)物中含有烷烴類、酯類、醇類、醛酮類、羧酸類和胺類等小分子物質(zhì)，相對分子量在70～370。