楊士鵬，劉 穎，王馨悅，楊 洋，全吉淑，林貞花

1.延邊大學(xué)腫瘤研究中心，吉林 延吉 133002；2.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院外科，吉林 延吉 133002；3.民族地區(qū)高發(fā)腫瘤病理生物學(xué)國家民委重點實驗室（延邊大學(xué)），吉林 延吉133002 4.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，吉林 延吉133002

胰腺癌惡性程度高，其發(fā)病率呈逐年上升及年輕化趨勢，病死率在惡性腫瘤中位居第4［1］。由于胰腺癌早期診斷困難，侵襲性強，惡性程度高［2-3］，患者的5年生存率<1%［4］。隨著基因組學(xué)和蛋白組學(xué)的快速發(fā)展，涌現(xiàn)出大量生物學(xué)分子標(biāo)志物如CA19-9、CEA、CA242、OPN等，但特異性和敏感性等仍顯不足［5］。因此，闡明胰腺癌的潛在分子機制并尋找更有效的腫瘤分子標(biāo)志物對于胰腺癌早期診斷及分子靶向治療至關(guān)重要。

丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）是糖酵解途徑中的關(guān)鍵限速酶，可催化磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，同時使ADP轉(zhuǎn)化為ATP以供給細胞能量［6］。PK家族主要包括4種同工酶，分別是PKLR基因編碼的PK-L、PK-R以及PKM2基因編碼的M1和M2［7］。其中，PKLR基因位于染色體1q21，共包含12個外顯子，主要表達于肝臟、紅細胞中［8］。有報道稱，PKLR基因缺陷是紅細胞丙酮酸激酶缺乏的主要原因，也是遺傳性非球形細胞溶血性貧血的常見原因［9-10］。近年的研究［11-12］顯示，PKLR在腫瘤的惡性演進中扮演著重要的促進作用。Nguyen等［11］報道，PKLR蛋白的表達與結(jié)直腸癌患者的臨床分期和分化程度密切相關(guān)，其高表達提示患者的不良預(yù)后。Niinivirta等［12］亦證實，PKLR與腎細胞癌的惡性演進密切相關(guān)。本文旨在探究PKLR蛋白對胰腺癌細胞生物學(xué)行為的影響，為胰腺癌早期診斷及靶向治療提供可能的分子標(biāo)志物。

1 材料和方法

1.1 細胞系

人胰腺癌BxPC-3和MIA PaCa-2細胞，購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.2 材料

組織芯片購自上海芯超生物科技有限公司，包括109例胰腺癌組織和28例癌旁胰腺組織標(biāo)本。統(tǒng)計109例胰腺癌標(biāo)本的臨床病理學(xué)資料（部分臨床數(shù)據(jù)缺失）：男性59例，女性50例；年齡＜60歲的患者數(shù)為41例，≥60的患者數(shù)為68例；腫瘤直徑＜3.0 cm的患者數(shù)為15例，≥3.0 cm的患者數(shù)為37例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者數(shù)為60例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者數(shù)為46例；胰腺癌組織分化程度：高分化者7例，中分化者41例，低分化者14例；胰腺癌組織分期分析：Ⅰ+Ⅱ期87例，Ⅲ+Ⅳ期22例。

1.3 試劑

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶等試劑購自美國Gibco公司；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate-buffered saline，PBS）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、Hoechst33342熒光染料、MTT［3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide］購自北京索萊寶生物科技有限公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；熒光二抗Alexa Fluor468購自美國Invitrogen公司，分裝保存于-20 ℃冰箱。

1.4 儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱，全波長多功能酶標(biāo)儀。光學(xué)倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，臺式高速離心機購自美國Thermo公司。

1.5 細胞培養(yǎng)

將BxPC-3和MIA PaCa-2細胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6 MTT實驗

將BxPC-3和MIA PaCa-2細胞以每孔100 μL（1×103個細胞）接種于96孔板，每個濃度設(shè)5個平行復(fù)孔。次日，每孔加入5 mL/mg的MTT溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清液，加入DMSO，振蕩，用全波長酶標(biāo)儀于490 nm和570 nm波長測定吸光度（D）值。根據(jù)公式計算：細胞生存率=D處理組/D對照組×100%。

1.7 平板克隆形成實驗

取對數(shù)生長期的BxPC-3和MIA PaCa-2細胞，以每孔2 000個的細胞密度接種于6孔板中，次日更換為完全培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，肉眼可見含有60個以上的細胞集落時，用預(yù)冷PBS清洗2次，室溫下4%多聚甲醛固定15 min，蘇木精染液染色，自然干燥后拍照。

1.8 細胞劃痕實驗

將細胞等量接種于6孔板中，待細胞的融合度達到80%～90%時，用200 μL移液器吸嘴劃痕。加入DMEM培養(yǎng)基，分別處理0、24和48 h后觀察，拍照，測量劃痕間距，根據(jù)公式計算劃痕愈合率：劃痕愈合率%=（0 h劃痕寬度-24 h/48 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.9 Transwell實驗

將BxPC-3和MIA PaCa-2細胞消化、離心，并以100 μL（3×105個細胞）接種于transwell上室。細胞貼壁后，上室分別加入DMEM培養(yǎng)基（無血清），下室加入含20%血清的DMEM培養(yǎng)基。于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后終止培養(yǎng)，依次進行固定、結(jié)晶紫染色、脫色、擦去上室細胞、取膜、封片后，于顯微鏡下觀察、拍照。

1.10 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測

BxPC-3和MIA PaCa-2細胞經(jīng)處理48 h后，收集各組細胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取20 μg蛋白依次進行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉后，一抗（1∶1 000）4 ℃溫育過夜。次日，洗膜，二抗（1∶3 000）室溫溫育2 h后，ECL法顯影、曝光。以β-actin為內(nèi)參，評價各目的蛋白的相對表達水平。

1.11 免疫組織化學(xué)染色

制備4 μm厚連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，抗原修復(fù)，滴加抗PKLR抗體（稀釋比例1∶100），4 ℃溫育過夜；次日滴加二抗，DAB顯色，蘇木精對比染色，中性樹膠封片。為證明PKLR抗體免疫組織化學(xué)檢測的特異性，選用PKLR陽性染色的切片，以PBS代替一抗的染色結(jié)果作為陰性對照。以著色強度及著色細胞數(shù)綜合計算作為PKLR陽性染色評分標(biāo)準(zhǔn)。按陽性細胞染色強度計分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按著色陽性細胞數(shù)計分：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為 4分；染色強度與著色細胞數(shù)得分相乘，0～1分為陰性（-），2～4分為弱陽性（+），5～7分為中度陽性（++），≥8分為強陽性（+++）。

1.12 免疫熒光染色

在6孔板中放置滅菌處理好的蓋玻片并接種細胞，各組細胞經(jīng)PKLR處理48 h后，依次進行多聚甲醛固定、TritonX-100透化、牛血清封閉后，一抗（1∶500）4 ℃溫育過夜。次日洗滌，熒光二抗（1∶400）室溫避光溫育2 h。洗滌后，DAPI染色，封片，于熒光顯微鏡下拍照。

1.13 小干擾RNA轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板，分別設(shè)si-control組和si-PKLR組，次日待細胞生長至30%～50%，si-control組加入2 mL正常完全培養(yǎng)液，si-PKLR組分別加入含1.5 mL的無血清無雙抗DMEM培養(yǎng)液、250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基，A管加入5 μL的LipofectamineTM3000和B管加入 5 μL的si-PKLR，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，進行Western blot檢測、MTT實驗、細胞劃痕實驗、transwell實驗、平板克隆形成實驗。

1.14 統(tǒng)計學(xué)處理

本實驗中所有的數(shù)據(jù)全部采用SPSS 25.0軟件和GraphPad Prism7.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理；實驗數(shù)據(jù)全部采用表示；多組之間數(shù)據(jù)的比較使用單因素方差分析；對于兩個獨立樣本的互相比較采用t檢驗；PKLR蛋白表達與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性分析采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗法，每組實驗均重復(fù)3次以上。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PKLR蛋白定位于胰腺癌細胞的細胞質(zhì)中

免疫熒光染色結(jié)果顯示：PKLR的熒光信號主要定位于BxPC-3和MIA PaCa-2胰腺癌細胞的細胞質(zhì)中（圖1）。

圖1 PKLR蛋白定位于BxPC-3和MIA PaCa-2胰腺癌細胞的細胞質(zhì)（×200）Fig.1 The PKLR was mainly located in the cytoplasm of BxPC-3 and MIA PaCa-2 cells（×200）

2.2 PKLR蛋白在胰腺癌組織中呈高表達

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PKLR蛋白主要表達于胰腺癌細胞BxPC-3和MIA PaCa-2的細胞質(zhì)，與免疫熒光結(jié)果相一致。其在正常胰腺組織中呈陰性，在胰腺癌組織中呈陽性/強陽性（圖2A）。進一步統(tǒng)計其陽性率發(fā)現(xiàn)，PKLR蛋白在胰腺癌組織中的陽性表達率和強陽性表達率分別為75.2%（82/109）和48.6%（53/109），顯著高于其在正常胰腺組織中的表達（14.3%和7.1%，P＜0.01，圖2B）。

圖2 PKLR蛋白在胰腺癌組織中的陽性表達顯著高于在癌旁正常組織中的表達水平（×200）Fig.2 The protein expression of PKLR in normal pancreatic tissues adjacent to tumor and pancreatic cancer tissues

2.3 PKLR蛋白過表達與胰腺癌患者組織分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)

進一步探究PKLR蛋白過表達與胰腺癌患者臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)：PKLR過表達與胰腺癌患者的組織學(xué)分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05），但與胰腺癌患者性別、年齡、臨床分期、腫瘤大小等無明顯相關(guān)性（P＞0.05，表1）。其中，PKLR在低分化組織中的強陽性率（85.7%，12/14）明顯高于中分化組織（46.3%，19/41）和高分化組織（42.8%，3/7）（P＜0.030）；在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的胰腺癌組織中，PKLR表達強陽性率為（75.0%，45/60），亦顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織（56.5%，26/46），提示PKLR蛋白與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)（P＜0.029，圖3）。

圖3 PKLR蛋白過表達與胰腺癌組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)Fig.3 Relationship between overexpression of PKLR and clinicopathological features in patients with pancreatic cancer

表1 PKLR表達水平與胰腺癌臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系Tab.1 Relationship between PKLR expression level and clinicopathological parameters of pancreatic cancer

2.4 PKLR下調(diào)明顯抑制胰腺癌細胞的增殖

進一步采用小干擾RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)敲減PKLR表達后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，PKLR在胰腺癌細胞中的蛋白水平明顯下調(diào)（圖4A）；MTT結(jié)果顯示，與對照組相比，si-PKLR #1、si-PKLR #2組細胞增殖活性明顯受到抑制，且呈時間依賴性（P＜0.05，圖4B）；平板克隆實驗結(jié)果與之相一致，敲減PKLR可顯著減少BxPC-3和MIA PaCa-2細胞的集落形成數(shù)量（圖4C），提示PKLR下調(diào)可抑制胰腺癌細胞的增殖能力。

圖4 PKLR下調(diào)對胰腺癌細胞增殖能力的影響Fig.4 Inhibition of PKLR attenuated the proliferative abilities of BxPC-3 and MIA PaCa-2 cells

2.5 PKLR下調(diào)抑制胰腺癌細胞的遷移能力

細胞劃痕實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，si-PKLR #1、si-PKLR #2作用細胞0、24和48 h后，與對照組相比，si-PKLR #1、si-PKLR #2處理組細胞橫向遷移距離明顯縮短（圖5A）；進一步的transwell實驗結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，PKLR表達下調(diào)后，胰腺癌細胞的縱向遷移能力明顯受到抑制（P＜0.05），（圖5B），提示敲減PKLR表達可抑制胰腺癌細胞的遷移能力。

圖5 敲減PKLR對胰腺癌細胞遷移能力的影響 Fig.5 Inhibition of PKLR attenuated the migration abilities of BxPC-3 and MIA PaCa-2 cells

2.6 PKLR下調(diào)通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transformation，EMT）途徑抑制胰腺癌細胞的遷移

進一步通過Western blot檢測PKLR對EMT標(biāo)志物的影響發(fā)現(xiàn)，si-PKLR #1、si-PKLR #2處理細胞后，上皮表型標(biāo)志物E-cadherin的表達明顯上調(diào)，間充質(zhì)表型標(biāo)志物vimentin及snail的表達明顯下調(diào)（P＜0.01，圖6），提示PKLR可能通過EMT途徑調(diào)控胰腺癌細胞的遷移。

圖6 Western blot檢測PKLR下調(diào)后EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達水平Fig.6 Inhibition of PKLR attenuated the migration abilities of BxPC-3 and MIA PaCa-2 cells through the EMT pathway detected by Western blot

*:P<0.05,#:Some of the data were missing

3 討 論

PKLR作為糖酵解途徑的關(guān)鍵限速酶之一，其不僅調(diào)控糖代謝重編程，而且在類固醇和脂肪酸等能量代謝過程中發(fā)揮著重要作用［13-14］。Nie等［15］研究揭示，鹽皮質(zhì)激素受體通過miR-338-3p/PKLR信號軸調(diào)控肝癌的瓦博格效應(yīng)，進而抑制肝癌的惡性增殖。Nguyen等［11］研究發(fā)現(xiàn)，PKLR通過誘導(dǎo)谷胱甘肽合成進而促進結(jié)直腸癌細胞肝轉(zhuǎn)移。Rudnicka等［16］報道，PKLR在胃癌組織中異常高表達，且可正向調(diào)控胃癌細胞的增殖、周期阻滯和凋亡。Shaikh等［18］研究亦證實，下調(diào)PKLR表達可抑制頭頸部鱗狀細胞癌的增殖、侵襲和遷移，與頭頸部鱗狀細胞癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。以上研究提示，PKLR在腫瘤中異常表達并與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

在本研究中，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示PKLR蛋白在胰腺癌組織中的表達水平顯著高于正常胰腺組織；進一步分析PKLR高表達與胰腺癌臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PKLR在晚期（Ⅲ～Ⅳ期）及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織中的強陽性表達率（57.1%vs75.0%）均顯著高于早期（Ⅰ～Ⅱ期）和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌（47.1%vs56.5%，P＜0.05）。

Wang等［19］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP1通過調(diào)控PKLR的表達進而促進膽囊癌的增殖和轉(zhuǎn)移。為進一步探究PKLR在胰腺癌演進中的分子機制，本研究運用小RNA干擾技術(shù)敲減PKLR表達分析其對胰腺癌細胞生物學(xué)行為的影響。MTT實驗及平板克隆實驗顯示，PKLR表達下調(diào)可顯著抑制胰腺癌細胞的增殖及平板克隆形成能力；進一步的細胞劃痕實驗、transwell實驗結(jié)果顯示，敲減PKLR表達對胰腺癌細胞的橫向及縱向遷移能力均有明顯的抑制作用，提示PKLR在胰腺癌的增殖和遷移過程中扮演著重要角色。眾所周知，EMT進程是促使腫瘤上皮細胞獲得較高的遷移及侵襲能力的原因之一，也是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟［19］。為此，本研究運用Western blot檢測PKLR表達下調(diào)后對EMT相關(guān)標(biāo)志物的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上皮表型標(biāo)志物E-cadherin表達明顯上調(diào)，而間充質(zhì)表型標(biāo)志物vimentin及snail表達明顯下調(diào)。上述結(jié)果與本課題組前期研究結(jié)果相一致，即PKLR作為NQO1的靶蛋白，下調(diào)PKLR表達可顯著抑制NQO1誘導(dǎo)的EMT進程［20］，提示PKLR可能通過EMT途徑促進了胰腺癌的轉(zhuǎn)移。

總之，本研究表明，PKLR蛋白在胰腺癌組織中呈高表達，并與胰腺癌患者的組織學(xué)分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切；敲減PKLR蛋白表達可抑制胰腺癌細胞的增殖、遷移及EMT進程，提示PKLR蛋白可能參與胰腺癌的演進，有望成為胰腺癌早期診斷的生物標(biāo)志物和治療的靶點。