孫永杰 龐偉蘋 葉發(fā)剛

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部臨床醫(yī)學(xué)系，山東 青島 266003； 2 青島大學(xué)附屬醫(yī)院創(chuàng)傷外科；3 單縣中心醫(yī)院骨三科； 4 青島大學(xué)附屬醫(yī)院嶗山院區(qū)心內(nèi)科)

軟骨缺損是骨科常見的疾病之一，如果不及時治療，會導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎(OA)發(fā)生和進展，嚴(yán)重影響患者的運動功能和降低生活質(zhì)量[1-3]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)是干細(xì)胞組織工程中常見的種子細(xì)胞，具有來源廣泛、無排異反應(yīng)的特點[4-5]。既往也有應(yīng)用BMSC移植促進軟骨缺損修復(fù)的研究，但是因為干細(xì)胞具有多分化潛能，轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞的效率較低[6-7]。而轉(zhuǎn)化生長因子-β3(TGF-β3)可以特異性誘導(dǎo)BMSC向軟骨細(xì)胞分化[8-9]。角蛋白支架系統(tǒng)是組織工程領(lǐng)域較為先進的支架結(jié)構(gòu)，具有組織兼容性好、硬度適合、易分解的特點[10-11]。本研究利用新西蘭大白兔構(gòu)建脛骨側(cè)軟骨缺損動物模型，將TGF-β3基因的過表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSC并聯(lián)合角蛋白支架對軟骨缺損部位進行填充，利用蘇木精-伊紅(HE)染色、番紅-固綠染色和免疫組織化學(xué)染色等方法檢測軟骨缺損的修復(fù)情況，以期為臨床上軟骨缺損的治療提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 動物來源

新西蘭種大白兔20只購自濟南實驗動物中心，清潔級實驗動物，雄性，年齡為(12.97±1.21)月，合格證書為(SCXK(魯)2018-1119)。本研究方案通過青島大學(xué)附屬醫(yī)院動物倫理委員會的批準(zhǔn)[批準(zhǔn)號：CN(魯)B2020-7845]。

1.2 試劑

DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和HE染液均購自北京碧云天科技有限公司，胎牛血清(FBS)購自以色列BI公司，Aggrecan和Ⅱ型膠原蛋白一抗購自英國Abcam生物技術(shù)有限公司。

1.3 兔源BMSC的提取和鑒定

大白兔1只，采用含體積分?jǐn)?shù)0.10的水合氯醛(2～3 mL/kg)腹腔注射麻醉后抽取股骨骨髓2～3 mL。然后加入4 mL含體積分?jǐn)?shù)0.20的FBS的DMEM培養(yǎng)基，接種在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.15的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d更換DMEM培養(yǎng)基一次，待細(xì)胞融合率達80%時，進行細(xì)胞傳代。培養(yǎng)72 h后，倒置光學(xué)顯微鏡下觀察原代BMSC和P3代BMSC，對P3代BMSC按照試劑盒說明書要求，采用流式細(xì)胞儀檢測BMSC表面CD34、CD45、CD90和CD44蛋白的表達水平。

1.4 TGF-β3基因過表達載體質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染

TGF-β3基因過表達載體的構(gòu)建和篩選由上海吉瑪生物有限公司完成。TGF-β3基因引物序列為5′-AATTGCCTAAAAGTCCTGCC-3′。將目的基因擴增序列加入線性化表達載體，選取上海吉凱生物技術(shù)有限公司提供的hU6-MCS-CMV-EGFP慢病毒載體作為酶切對象，加入過表達載體序列后進行克隆測定，然后進行質(zhì)粒的抽提，慢病毒包裝后轉(zhuǎn)染BMSC，同時將綠色熒光蛋白(GFP)包裹于慢病毒載體質(zhì)粒中。TGF-β3基因過表達載體質(zhì)粒通過慢病毒轉(zhuǎn)染BMSC后，利用倒置熒光顯微鏡分別于熒光下和白光下觀察BMSC細(xì)胞及其數(shù)量，計算慢病毒的轉(zhuǎn)染率，轉(zhuǎn)染率=熒光下細(xì)胞數(shù)/白光下細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5 鹽瀝濾法構(gòu)建角蛋白支架

將10 g/L的角蛋白與500 μm NaCl顆粒充分混合，室溫下風(fēng)干、成形。根據(jù)軟骨缺損的大小進行修剪和塑形。消毒后備用，再利用透射電子顯微鏡(TEM)不同視窗觀察角蛋白支架形態(tài)。

1.6 動物分組與處理

根據(jù)處理方式不同將20只新西蘭種大白兔分為4組，每組5只。模型組(A組)僅進行膝關(guān)節(jié)脛骨側(cè)軟骨造模手術(shù)：將大白兔腹腔注射水合氯醛麻醉后，分別備皮2個后肢膝關(guān)節(jié)，切開關(guān)節(jié)腔，暴露脛骨側(cè)軟骨；用口腔鉆在軟骨上制作一3 mm×2 mm×1 mm大小的錐形軟骨缺損，生理鹽水沖洗后，逐層縫合切口，靜脈注射頭孢呋辛鈉抗感染處理。支架組(B組)大白兔膝關(guān)節(jié)脛骨側(cè)軟骨缺損造模成功后，于軟骨缺損處填充角蛋白支架，然后進行縫合和抗感染處理；聯(lián)合BMSC組(C組)大白兔膝關(guān)節(jié)脛骨側(cè)軟骨缺損造模成功后，于軟骨缺損處填充角蛋白支架聯(lián)合BMSC復(fù)合物，然后進行縫合和抗感染處理；聯(lián)合過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSC組(D組)：大白兔膝關(guān)節(jié)脛骨側(cè)軟骨缺損造模成功后，于軟骨缺損處填充角蛋白支架聯(lián)合TGF-β3基因過表達載體轉(zhuǎn)染的BMSC復(fù)合物，然后進行縫合和抗感染處理。處理完成后，兔正常飲食，12-12 h明暗交替光照，24 ℃恒溫、安靜環(huán)境中飼養(yǎng)1個月。然后所有兔均以耳緣靜脈注射空氣方式處死，取后肢軟骨缺損部分，以石臘包埋。

1.7 缺損軟骨修復(fù)情況觀察

將石蠟包埋標(biāo)本切片，嚴(yán)格按照說明書要求進行HE染色后，置于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察，利用改良O′Driscoll評分系統(tǒng)評估缺損軟骨修復(fù)情況。將切片標(biāo)本按照番紅-固綠染色說明書要求進行染色后，利用改良Mankin評分系統(tǒng)評估缺損軟骨修復(fù)情況。切片標(biāo)本中加入Ⅱ型膠原蛋白一抗4 ℃濕盒避光孵育過夜，PBS溶液沖洗3次；羊抗兔IgG二抗避光孵育30 min，PBS溶液沖洗3次；中性樹膠固定，倒置光學(xué)顯微鏡下觀察染色的強度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 兔源BMSC的培養(yǎng)和細(xì)胞表面CD分子的表達水平

原代BMSC呈多角形，貼壁生長，P3代BMSC呈長梭形(圖1)，表明細(xì)胞由幼稚的原代細(xì)胞已成長為成熟的細(xì)胞；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，P3代BMSC表面的CD34、CD45、CD90、CD44蛋白表達比率分別約為0.002、0.006、0.720、0.669，表明BMSC培養(yǎng)成功。

2.2 慢病毒的轉(zhuǎn)染率及角蛋白支架形態(tài)觀察

TGF-β3基因過表達載體質(zhì)粒通過慢病毒轉(zhuǎn)染BMSC的轉(zhuǎn)染率為(92.11±4.22)%。GFP綠色熒光染色結(jié)果顯示，慢病毒轉(zhuǎn)染成功的BMSC呈綠色熒光，細(xì)胞形態(tài)正常，質(zhì)粒均勻表達于BMSC內(nèi)；在同一白光下視野觀察到BMSC的細(xì)胞形態(tài)正常，呈梭形，無皺縮變形(圖2)。透射電子顯微鏡觀察角蛋白支架形態(tài)，15 μm視窗下可見角蛋白纖維條索規(guī)則，100 μm和1 mm視窗下可見角蛋白支架表面有大小不一的凹陷(圖3)。

2.3 各組兔缺損軟骨修復(fù)情況

HE染色和番紅-固綠染色結(jié)果顯示，A組可見大面積軟骨缺損，基底部可見軟骨下骨增生活躍；B組缺損處有少部分軟骨組織長入，但仍可見較大缺損；C組缺損處愈合較好，多為纖維愈合；D組軟骨缺損基本愈合，愈合處多為軟骨組織(圖4)。A組、B組、C組和D組O′Driscoll評分分別為18.45±2.65、14.09±1.59、13.02±1.33、10.02±0.59，各組間比較差異有顯著性(F=9.342，P<0.05)，其中D組O′Driscoll評分明顯低于其他組(q=2.018～2.498，P<0.05)；而B組和C組O′Driscoll評分比較差異無顯著性(P>0.05)。

A組、B組、C組和D組的Mankin評分分別為0.21±0.02、0.59±0.07、0.56±0.08、1.22±0.13，各組間比較差異具有顯著性(F=8.549，P<0.05)；其中D組Mankin評分明顯高于其他組(q=2.237～3.457，P<0.05)；而B組和C組比較差異無顯著性(P>0.05)。見圖5。

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，A組和B組缺損軟骨處可見少量Ⅱ型膠原蛋白表達，C組和D組缺損軟骨處均可見Ⅱ型膠原蛋白表達，C組多為纖維愈合，D組棕色染色更深，多為軟骨組織愈合。見圖6。

A：原代BMSC，B：P3代BMSC，200倍

A：熒光下視野，B：白光下視野，GFP綠色熒光染色，400倍

A～C分別為15、100 μm和1 mm視窗下結(jié)果

A～D分別為A～D組，200倍

A～D分別為A～D組，200倍

A～D分別為A～D組，200倍

3 討 論

軟骨缺損在關(guān)節(jié)外科中比較常見，多由直接或間接外力引起，導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)產(chǎn)生游離體，造成關(guān)節(jié)卡頓[12-13]。嚴(yán)重時可加劇關(guān)節(jié)磨損，可以造成OA的發(fā)生[14-15]。目前尚無有效的治療方案，主要通過關(guān)節(jié)鏡取出游離體、利用支具進行保護以及口服硫酸氨基葡萄糖等藥物進行治療，但臨床效果并不是非常理想[16-17]。即使手術(shù)后可以獲得短期的疼痛緩解，但從遠(yuǎn)期效果來看，OA的發(fā)生率增高[18]。所以，對于軟骨缺損修復(fù)的研究十分必要。

干細(xì)胞是組織工程領(lǐng)域常見的種子細(xì)胞，因其具有的多分化潛能可以在一定條件下向骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化[19-20]。既往圍繞干細(xì)胞分化的研究較多，徐青鐳等[21]對兔源BMSC進行分離培養(yǎng)后，利用堿性成纖維細(xì)胞生長因子和TGF進行細(xì)胞層面的誘導(dǎo)分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，堿性成纖維細(xì)胞生長因子和TGF可以促進BMSC向軟骨細(xì)胞分化，從而促進半月板組織的修復(fù)。楊昆等[22]通過構(gòu)建WNT2B過表達載體，以慢病毒轉(zhuǎn)染BMSC，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)WNT2B過表達的載體可以誘導(dǎo)BMSC向軟骨細(xì)胞分化。本研究通過分離并培養(yǎng)兔源BMSC，P3代BMSC表面的CD90蛋白和CD44蛋白表達量高，而CD34和CD45的表達量低，符合BMSC的特點，說明培養(yǎng)的細(xì)胞確為BMSC。然后以慢病毒攜帶TGF-β3基因過表達載體轉(zhuǎn)染BMSC，結(jié)果轉(zhuǎn)染率較高，說明TGF-β3基因過表達載體可以穩(wěn)定表達于BMSC。將兔按照不同的方法進行處理，免疫組化染色結(jié)果顯示，D組軟骨缺損處Ⅱ型膠原蛋白染色明顯高于其他組，說明TGF-β3基因過表達載體轉(zhuǎn)染的BMSC促進了成軟骨分化。

對于組織工程中支架的選擇，往往大多關(guān)注支架的組織兼容性、細(xì)胞吸附性以及是否易降解、是否可引起免疫反應(yīng)等方面[23-24]。目前可供選擇的有水凝膠支架、角蛋白支架、絲蛋白支架等[25-26]。既往研究中，角蛋白支架大多用于神經(jīng)再生組織工程，孫泉等[27]利用鹽析法構(gòu)建角蛋白支架，將神經(jīng)干細(xì)胞接種于角蛋白支架上，結(jié)果顯示，角蛋白可以促進神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化。部分研究表明，角蛋白可以作為骨組織工程和軟骨組織工程的支架[28-29]。本研究利用角蛋白作為支架，聯(lián)合BMSC，觀察其促軟骨分化情況，結(jié)果顯示，兔軟骨缺損處有少部分軟骨組織長入，但仍可見有缺損存在；C組軟骨缺損愈合較好，但多為纖維愈合；D組軟骨缺損愈合完全，組織嚴(yán)密，修復(fù)處多為軟骨組織。同時本研究還利用改良O′Driscoll評分對軟骨缺損修復(fù)情況進行評估，結(jié)果顯示，D組評分明顯低于其他組；Mankin評分結(jié)果顯示，D組評分明顯高于其他組，說明經(jīng)過TGF-β3基因過表達載體轉(zhuǎn)染的BMSC與角蛋白支架聯(lián)合處理后軟骨缺損修復(fù)組織多為軟骨組織，缺損軟骨愈合較好。

綜上所述，本研究將TGF-β3基因過表達載體通過慢病毒轉(zhuǎn)染BMSC，聯(lián)合角蛋白支架制備復(fù)合物，填充于新西蘭大白兔的膝關(guān)節(jié)軟骨缺損處，探究其對軟骨缺損的修復(fù)作用，結(jié)果表明，聯(lián)合過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BMSC干預(yù)后，軟骨缺損處基本愈合，組織嚴(yán)密，多為軟骨組織，說明角蛋白支架聯(lián)合TGF-β3基因過表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BMSC復(fù)合物可以有效促進軟骨缺損的修復(fù)，為臨床上軟骨缺損患者的治療提供了數(shù)據(jù)參考。但關(guān)于角蛋白支架聯(lián)合TGF-β3基因過表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSC修復(fù)軟骨缺損的具體機制，還有待進一步研究。