王振虹 姜永杰 徐雷 王沖 曲政海 郭沙沙，4

(1 青島大學附屬醫(yī)院教育培訓部，山東 青島 266003； 2 青島市西海岸新區(qū)中心醫(yī)院兒科；3 青島大學附屬醫(yī)院兒科； 4 貴州省人民醫(yī)院)

兒童和青少年社區(qū)獲得性肺炎高達40%是由肺炎支原體(MP)感染所導致[1]，兒童以及青少年為易感的人群[2]。MP肺炎可以導致急性呼吸窘迫綜合征[3]，少數(shù)可以發(fā)展成為重癥，嚴重威脅到兒童健康[4]。由MP引起的呼吸道疾病包括細支氣管炎、支氣管炎、閉塞性細支氣管炎和支氣管擴張等。近年來研究顯示，MP感染還可以引起兒童哮喘[5]。Toll樣受體(TLRs)作為模式識別受體，可以和病原體表面配體相結合，激活人體先天性免疫系統(tǒng)，對病原體微生物起到非特異性免疫作用，同時在特異性免疫應答中也起到重要的作用。近年來，動物實驗證實，TLRs在多種病原體感染相關實驗模型中表達水平均明顯升高[6]。TLRs、髓樣分化因子88(MyD88)與核轉錄因子κB(NF-κB)組成的信號通路在多種疾病發(fā)病及治療過程中發(fā)揮重要作用[7]。本研究在支原體肺炎(MPP)小鼠動物模型基礎上，探討TLR-MyD88-NF-κB信號通路在MPP發(fā)病中相關作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物來源及分組

健康SPF級BALB/c小鼠60只，雌雄各半，體質量14～18 g， 4～6周齡，置于青島大學附屬醫(yī)院動物實驗中心SPF級動物房中進行飼養(yǎng)，室溫控制在20～22 ℃，相對濕度60%～70%，12-12 h晝夜循環(huán)環(huán)境。由即墨市動物飼養(yǎng)所提供。MP血清學檢測呈陰性。按照數(shù)字表法將小鼠隨機分為MPP組(40只)和對照組(20只)。

1.2 材料和設備

MP(ATCC15331)FH 型標準株(上海佰泰科技有限公司)，IL-4、IL-6 ELISA試劑盒(美國R&D公司)，TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB p65山羊抗兔單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)。高速低溫離心機(美國Thermo公司)，RM2015型石蠟切片機(德國Leica公司)，BX51T-PHD-J11型顯微鏡(日本Olympus公司)，Roche Bench Mark XT染色機(瑞士Roche公司)。

1.3 MPP動物模型制備

MPP組參照文獻[8]中的方法制備MPP小鼠模型。使用體積分數(shù)0.10的水合氯醛麻醉小鼠后，將小鼠頭后仰30°～45°，將濃度為1010ccu/L的MP菌液0.1 mL滴入MPP組每只小鼠鼻腔，使菌液自鼻腔隨著呼吸自然流入下呼吸道，連續(xù)3 d；對照組小鼠以用等量的生理鹽水滴鼻，連續(xù)3 d。滴鼻后每天觀察兩組小鼠的精神狀態(tài)、活動度、飲食量、飲水次數(shù)及口鼻分泌物等情況變化。感染后第7天，觀察兩組小鼠臨床癥狀，記錄體質量。每組隨機挑選2只小鼠麻醉以后摘眼球采集血標本0.5 mL，靜置15 min后，3 000 r/min離心10 min，取上清液，后嚴格按照MP核酸檢測試劑盒說明書進行MP檢測，MP檢測陽性說明造模成功[9]。

1.4 支氣管肺泡灌洗液(BALF)制備

造模成功后，以水合氯醛快速麻醉小鼠后，行頸部手術分離氣管并插管，然后以0.5 mL PBS灌洗肺腔3次，收集BALF,并于-40 ℃儲存?zhèn)溆茫浠厥章始s可達到70%。

1.5 兩組小鼠BALF中IL-4、IL-6水平的測定

采用ELISA方法測定兩組小鼠BALF中IL-4、IL-6的水平，檢測步驟按照試劑盒說明書進行。

1.6 肺組織切片及HE染色

同上法麻醉小鼠后，打開胸腔，取出肺組織，采用稱質量法并按照公式(肺臟質量/體質量×100%)計算濕肺質量指數(shù)。后用40 g/L多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定12 h。常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)5 μm厚切片，切片按常規(guī)脫蠟入水，以蘇木精染色7 min，后伊紅染色4 min，再經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，以中性樹膠封片，然后置于光鏡下觀察肺組織病理變化情況。

1.7 免疫組化法檢測小鼠肺組織中TLR2、TLR4、MyD88與NF-κB p65的表達

肺組織切片常規(guī)脫蠟，配置枸櫞酸修復液，高壓5 min進行抗原修復；以過氧化氫溶液37 ℃避光孵育20 min以去除內源性過氧化物酶；山羊血清于37 ℃孵育60 min；滴加抗TLR2、TLR4、MyD88與NF-κB p65抗體(1∶200稀釋)，4 ℃過夜；二抗室溫孵育30 min；三抗室溫孵育30 min；DAB顯色，蒸餾水終止顯色；蘇木精復染，體積分數(shù)0.01鹽酸乙醇分化，氨水返藍，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，置于光學顯微鏡下觀察及拍照。光鏡下每標本隨機選取5個視野并采集圖像，使用Image-ProPlus系統(tǒng)對圖片進行分析，得到每個視野的吸光度(A)值，并計算每標本5個視野平均吸光度值的平均值。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 小鼠的一般狀況及MPP組小鼠建模情況

實驗第7天，對照組小鼠較為活潑，精神食欲良好，體質量增長良好。MPP組小鼠精神萎靡、活動減少、豎毛、寒戰(zhàn)、撓鼻，并出現(xiàn)生長抑制現(xiàn)象，且小鼠MP核酸檢測陽性，說明造模成功。

2.2 兩組小鼠肺組織觀察

對照組小鼠肺泡結構均勻清晰，肺泡內無滲出物，偶爾可見淋巴細胞和巨噬細胞浸潤，主要分布在支氣管、血管周圍及肺泡間隔附近(圖1A、B)。 MPP組小鼠氣管支氣管周圍及管腔內以淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤，血管周圍以淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤，肺泡結構破壞，肺泡內可見較多滲出物，肺泡間質明顯增寬，在支氣管和血管周圍及肺泡間質中有大量淋巴細胞和巨噬細胞浸潤(圖1C、D)。

A：對照組小鼠肺組織切片，HE染色，25倍；B：對照組小鼠肺組織切片，HE染色，400倍；C：MPP組小鼠肺組織病理切片，HE染色，25倍；D：MPP組小鼠肺組織病理切片，HE染色，400倍

2.3 兩組小鼠濕肺質量指數(shù)和BALF中IL-4、IL-6水平的變化情況

MPP組小鼠的濕肺質量指數(shù)明顯高于對照組(t=316.03,P<0.01)。MPP組BALF中IL-4、IL-6表達水平均明顯高于對照組(t=7.46、33.97，P<0.01)。見表1。

表1 兩組小鼠濕肺質量指數(shù)以及BALF中IL-4、IL-6水平比較

2.4 兩組小鼠的肺組織中TLR2、TLR4、MyD88及NF-κB p65表達水平比較

MPP組小鼠肺組織中TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB P65表達水平均明顯高于對照組(t=7.95～11.70，P<0.01)。見表2。

表2 兩組小鼠肺組織中TLR2、TLR4、MyD88、NF-κBP65表達水平

2.5 MPP組小鼠的肺組織中MyD88與TLR2、TLR4、NF-κBP65表達的相關性

MPP組小鼠肺組織中，TLR2和MYD88蛋白表達均陽性22例，均陰性14例，TLR4和MYD88蛋白表達均陽性23例，均陰性12例，Pearson相關分析顯示，MPP組小鼠肺組織中MyD88與TLR2、TLR4、NF-κB表達均呈正相關(r=0.554～0.622，P<0.01)。

3 討 論

MPP是一種兒童常見的社區(qū)獲得性呼吸道感染性疾病[10]，可引起較重的發(fā)熱、咳嗽、氣促以及肺功能降低等臨床癥狀，重癥支原體感染可引起肺外的一些并發(fā)癥[11]，治療難度加大，治療費用較高。MPP發(fā)病機制目前研究主要集中于病原微生物感染直接導致氣道黏膜損傷及免疫損傷，其中免疫損傷及相關信號通路研究是目前熱點[12]。

TLRs是一類重要的細胞膜和胞內受體，可識別多種微生物大分子[13]。研究顯示TLRs會募集MyD88，然后通過一系列信號傳導，促使中性粒細胞聚集、巨噬細胞活化、產(chǎn)生特異性抗體，以抵御入侵的病原體[14]。TLRs在抗原提呈細胞表面的表達豐富，不同的TLRs分子可以對各類病原體以及病原體產(chǎn)物的特殊蛋白結構做出識別，迅速啟動人體的先天性免疫系統(tǒng)，激活固有免疫系統(tǒng)，從而使人類具有先天性抗病原感染的能力[15]。

TLRs的信號轉導通路需要多種信號蛋白的參與，MyD88依賴型和MyD88非依賴型/TRIF依賴型信號通路是主要2條信號傳導通路[16]。MyD88是TLRs介導先天免疫反應的重要接頭蛋白，可以激活下游信號通路中NF-κB，最終引起炎癥遞質和細胞因子的釋放[17]。

TLR2和TLR4在MP感染中可以誘導機體對MP產(chǎn)生適當?shù)拿庖叻磻?，并可誘發(fā)MP相關并發(fā)癥如氣道高反應性[18]。研究顯示，MP感染可通過TLR信號通路加重對機體的免疫損傷[19]。本研究結果亦顯示，MyD88與TLR4、NF-κB的表達呈正相關，從而證實TLR4是通過MyD88依賴途徑進行信號傳遞，MyD88通過募集IL-1受體相關激酶(IRAK)1、IRAK4、TRAF6等信號分子，使NF-κB活化，引起炎性細胞因子釋放，進而導致氣道黏膜免疫損傷。說明TLR-MyD88-NF-κB是重要的信號傳導通路，在機體非特異性和特異性免疫應答反應中均起到重要作用，該通路能調節(jié)機體多種免疫效應蛋白和炎癥因子的表達[20]。

本研究目的是采用MP感染小鼠模型來重現(xiàn)人MP感染過程，探討MP感染后TLR-MyD88-NF-κB信號通路在誘導肺部炎癥中的作用機制。本研究結果顯示，光鏡下MPP組小鼠肺組織可見大量淋巴細胞以及巨噬細胞等炎癥細胞浸潤，BALF中IL-4、IL-6等細胞因子表達水平明顯升高，肺組織中TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB P65表達水平明顯高于對照組。另外，TLR4、TLR2表達量與轉接蛋白MyD88及NF-κB表達量呈正相關。推測MP感染可致TLR2、TLR4表達水平升高，活化MyD88-NF-κB信號通路，誘導多種炎癥因子產(chǎn)生，其中以IL-4、IL-6等細胞因子為著，導致局部過度炎癥反應，破壞肺泡結構，同時誘導氣道黏液高分泌，進一步加重肺損傷。

綜上所述，MP感染可能是通過TLR-MyD88-NF-κB信號通路的活化，誘導機體產(chǎn)生炎性肺損傷，并參與MP感染后的氣道黏膜的免疫損傷。