王振虹 姜永杰 徐雷 王沖 曲政海 郭沙沙，4

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院教育培訓(xùn)部，山東 青島 266003； 2 青島市西海岸新區(qū)中心醫(yī)院兒科；3 青島大學(xué)附屬醫(yī)院兒科； 4 貴州省人民醫(yī)院)

兒童和青少年社區(qū)獲得性肺炎高達40%是由肺炎支原體(MP)感染所導(dǎo)致[1]，兒童以及青少年為易感的人群[2]。MP肺炎可以導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征[3]，少數(shù)可以發(fā)展成為重癥，嚴(yán)重威脅到兒童健康[4]。由MP引起的呼吸道疾病包括細支氣管炎、支氣管炎、閉塞性細支氣管炎和支氣管擴張等。近年來研究顯示，MP感染還可以引起兒童哮喘[5]。Toll樣受體(TLRs)作為模式識別受體，可以和病原體表面配體相結(jié)合，激活人體先天性免疫系統(tǒng)，對病原體微生物起到非特異性免疫作用，同時在特異性免疫應(yīng)答中也起到重要的作用。近年來，動物實驗證實，TLRs在多種病原體感染相關(guān)實驗?zāi)Ｐ椭斜磉_水平均明顯升高[6]。TLRs、髓樣分化因子88(MyD88)與核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)組成的信號通路在多種疾病發(fā)病及治療過程中發(fā)揮重要作用[7]。本研究在支原體肺炎(MPP)小鼠動物模型基礎(chǔ)上，探討TLR-MyD88-NF-κB信號通路在MPP發(fā)病中相關(guān)作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物來源及分組

健康SPF級BALB/c小鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量14～18 g， 4～6周齡，置于青島大學(xué)附屬醫(yī)院動物實驗中心SPF級動物房中進行飼養(yǎng)，室溫控制在20～22 ℃，相對濕度60%～70%，12-12 h晝夜循環(huán)環(huán)境。由即墨市動物飼養(yǎng)所提供。MP血清學(xué)檢測呈陰性。按照數(shù)字表法將小鼠隨機分為MPP組(40只)和對照組(20只)。

1.2 材料和設(shè)備

MP(ATCC15331)FH 型標(biāo)準(zhǔn)株(上海佰泰科技有限公司)，IL-4、IL-6 ELISA試劑盒(美國R&D公司)，TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB p65山羊抗兔單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。高速低溫離心機(美國Thermo公司)，RM2015型石蠟切片機(德國Leica公司)，BX51T-PHD-J11型顯微鏡(日本Olympus公司)，Roche Bench Mark XT染色機(瑞士Roche公司)。

1.3 MPP動物模型制備

MPP組參照文獻[8]中的方法制備MPP小鼠模型。使用體積分數(shù)0.10的水合氯醛麻醉小鼠后，將小鼠頭后仰30°～45°，將濃度為1010ccu/L的MP菌液0.1 mL滴入MPP組每只小鼠鼻腔，使菌液自鼻腔隨著呼吸自然流入下呼吸道，連續(xù)3 d；對照組小鼠以用等量的生理鹽水滴鼻，連續(xù)3 d。滴鼻后每天觀察兩組小鼠的精神狀態(tài)、活動度、飲食量、飲水次數(shù)及口鼻分泌物等情況變化。感染后第7天，觀察兩組小鼠臨床癥狀，記錄體質(zhì)量。每組隨機挑選2只小鼠麻醉以后摘眼球采集血標(biāo)本0.5 mL，靜置15 min后，3 000 r/min離心10 min，取上清液，后嚴(yán)格按照MP核酸檢測試劑盒說明書進行MP檢測，MP檢測陽性說明造模成功[9]。

1.4 支氣管肺泡灌洗液(BALF)制備

造模成功后，以水合氯醛快速麻醉小鼠后，行頸部手術(shù)分離氣管并插管，然后以0.5 mL PBS灌洗肺腔3次，收集BALF,并于-40 ℃儲存?zhèn)溆?，其回收率約可達到70%。

1.5 兩組小鼠BALF中IL-4、IL-6水平的測定

采用ELISA方法測定兩組小鼠BALF中IL-4、IL-6的水平，檢測步驟按照試劑盒說明書進行。

1.6 肺組織切片及HE染色

同上法麻醉小鼠后，打開胸腔，取出肺組織，采用稱質(zhì)量法并按照公式(肺臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%)計算濕肺質(zhì)量指數(shù)。后用40 g/L多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定12 h。常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)5 μm厚切片，切片按常規(guī)脫蠟入水，以蘇木精染色7 min，后伊紅染色4 min，再經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，以中性樹膠封片，然后置于光鏡下觀察肺組織病理變化情況。

1.7 免疫組化法檢測小鼠肺組織中TLR2、TLR4、MyD88與NF-κB p65的表達

肺組織切片常規(guī)脫蠟，配置枸櫞酸修復(fù)液，高壓5 min進行抗原修復(fù)；以過氧化氫溶液37 ℃避光孵育20 min以去除內(nèi)源性過氧化物酶；山羊血清于37 ℃孵育60 min；滴加抗TLR2、TLR4、MyD88與NF-κB p65抗體(1∶200稀釋)，4 ℃過夜；二抗室溫孵育30 min；三抗室溫孵育30 min；DAB顯色，蒸餾水終止顯色；蘇木精復(fù)染，體積分數(shù)0.01鹽酸乙醇分化，氨水返藍，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察及拍照。光鏡下每標(biāo)本隨機選取5個視野并采集圖像，使用Image-ProPlus系統(tǒng)對圖片進行分析，得到每個視野的吸光度(A)值，并計算每標(biāo)本5個視野平均吸光度值的平均值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 小鼠的一般狀況及MPP組小鼠建模情況

實驗第7天，對照組小鼠較為活潑，精神食欲良好，體質(zhì)量增長良好。MPP組小鼠精神萎靡、活動減少、豎毛、寒戰(zhàn)、撓鼻，并出現(xiàn)生長抑制現(xiàn)象，且小鼠MP核酸檢測陽性，說明造模成功。

2.2 兩組小鼠肺組織觀察

對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)均勻清晰，肺泡內(nèi)無滲出物，偶爾可見淋巴細胞和巨噬細胞浸潤，主要分布在支氣管、血管周圍及肺泡間隔附近(圖1A、B)。 MPP組小鼠氣管支氣管周圍及管腔內(nèi)以淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤，血管周圍以淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡內(nèi)可見較多滲出物，肺泡間質(zhì)明顯增寬，在支氣管和血管周圍及肺泡間質(zhì)中有大量淋巴細胞和巨噬細胞浸潤(圖1C、D)。

A：對照組小鼠肺組織切片，HE染色，25倍；B：對照組小鼠肺組織切片，HE染色，400倍；C：MPP組小鼠肺組織病理切片，HE染色，25倍；D：MPP組小鼠肺組織病理切片，HE染色，400倍

2.3 兩組小鼠濕肺質(zhì)量指數(shù)和BALF中IL-4、IL-6水平的變化情況

MPP組小鼠的濕肺質(zhì)量指數(shù)明顯高于對照組(t=316.03,P<0.01)。MPP組BALF中IL-4、IL-6表達水平均明顯高于對照組(t=7.46、33.97，P<0.01)。見表1。

表1 兩組小鼠濕肺質(zhì)量指數(shù)以及BALF中IL-4、IL-6水平比較

2.4 兩組小鼠的肺組織中TLR2、TLR4、MyD88及NF-κB p65表達水平比較

MPP組小鼠肺組織中TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB P65表達水平均明顯高于對照組(t=7.95～11.70，P<0.01)。見表2。

表2 兩組小鼠肺組織中TLR2、TLR4、MyD88、NF-κBP65表達水平

2.5 MPP組小鼠的肺組織中MyD88與TLR2、TLR4、NF-κBP65表達的相關(guān)性

MPP組小鼠肺組織中，TLR2和MYD88蛋白表達均陽性22例，均陰性14例，TLR4和MYD88蛋白表達均陽性23例，均陰性12例，Pearson相關(guān)分析顯示，MPP組小鼠肺組織中MyD88與TLR2、TLR4、NF-κB表達均呈正相關(guān)(r=0.554～0.622，P<0.01)。

3 討 論

MPP是一種兒童常見的社區(qū)獲得性呼吸道感染性疾病[10]，可引起較重的發(fā)熱、咳嗽、氣促以及肺功能降低等臨床癥狀，重癥支原體感染可引起肺外的一些并發(fā)癥[11]，治療難度加大，治療費用較高。MPP發(fā)病機制目前研究主要集中于病原微生物感染直接導(dǎo)致氣道黏膜損傷及免疫損傷，其中免疫損傷及相關(guān)信號通路研究是目前熱點[12]。

TLRs是一類重要的細胞膜和胞內(nèi)受體，可識別多種微生物大分子[13]。研究顯示TLRs會募集MyD88，然后通過一系列信號傳導(dǎo)，促使中性粒細胞聚集、巨噬細胞活化、產(chǎn)生特異性抗體，以抵御入侵的病原體[14]。TLRs在抗原提呈細胞表面的表達豐富，不同的TLRs分子可以對各類病原體以及病原體產(chǎn)物的特殊蛋白結(jié)構(gòu)做出識別，迅速啟動人體的先天性免疫系統(tǒng)，激活固有免疫系統(tǒng)，從而使人類具有先天性抗病原感染的能力[15]。

TLRs的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路需要多種信號蛋白的參與，MyD88依賴型和MyD88非依賴型/TRIF依賴型信號通路是主要2條信號傳導(dǎo)通路[16]。MyD88是TLRs介導(dǎo)先天免疫反應(yīng)的重要接頭蛋白，可以激活下游信號通路中NF-κB，最終引起炎癥遞質(zhì)和細胞因子的釋放[17]。

TLR2和TLR4在MP感染中可以誘導(dǎo)機體對MP產(chǎn)生適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)，并可誘發(fā)MP相關(guān)并發(fā)癥如氣道高反應(yīng)性[18]。研究顯示，MP感染可通過TLR信號通路加重對機體的免疫損傷[19]。本研究結(jié)果亦顯示，MyD88與TLR4、NF-κB的表達呈正相關(guān)，從而證實TLR4是通過MyD88依賴途徑進行信號傳遞，MyD88通過募集IL-1受體相關(guān)激酶(IRAK)1、IRAK4、TRAF6等信號分子，使NF-κB活化，引起炎性細胞因子釋放，進而導(dǎo)致氣道黏膜免疫損傷。說明TLR-MyD88-NF-κB是重要的信號傳導(dǎo)通路，在機體非特異性和特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)中均起到重要作用，該通路能調(diào)節(jié)機體多種免疫效應(yīng)蛋白和炎癥因子的表達[20]。

本研究目的是采用MP感染小鼠模型來重現(xiàn)人MP感染過程，探討MP感染后TLR-MyD88-NF-κB信號通路在誘導(dǎo)肺部炎癥中的作用機制。本研究結(jié)果顯示，光鏡下MPP組小鼠肺組織可見大量淋巴細胞以及巨噬細胞等炎癥細胞浸潤，BALF中IL-4、IL-6等細胞因子表達水平明顯升高，肺組織中TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB P65表達水平明顯高于對照組。另外，TLR4、TLR2表達量與轉(zhuǎn)接蛋白MyD88及NF-κB表達量呈正相關(guān)。推測MP感染可致TLR2、TLR4表達水平升高，活化MyD88-NF-κB信號通路，誘導(dǎo)多種炎癥因子產(chǎn)生，其中以IL-4、IL-6等細胞因子為著，導(dǎo)致局部過度炎癥反應(yīng)，破壞肺泡結(jié)構(gòu)，同時誘導(dǎo)氣道黏液高分泌，進一步加重肺損傷。

綜上所述，MP感染可能是通過TLR-MyD88-NF-κB信號通路的活化，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生炎性肺損傷，并參與MP感染后的氣道黏膜的免疫損傷。