鄭文祥 王軍 楊茜 周娜 侯琳

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266071 1 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系； 2 病理系)

乳腺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)位居女性癌癥死亡原因的首位[1-2]。隨著綜合療法的發(fā)展，乳腺癌患者的生存率有了顯著提高。阿霉素是廣泛用于乳腺癌治療的蒽環(huán)類(lèi)藥物[3]，目前脂質(zhì)體[4-5]、新型納米材料[6]等與阿霉素的聯(lián)合應(yīng)用在臨床顯示了良好的治療效果。盡管阿霉素對(duì)乳腺癌具有顯著的療效，但由于其耐藥性[7]，導(dǎo)致一些患者的預(yù)后仍然較差。耐藥還可導(dǎo)致乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移概率增加，從而影響患者的預(yù)后[8]。因此，如何逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受性成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一。

腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制非常復(fù)雜[9]，其中一些與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的蛋白異常表達(dá)是一個(gè)重要原因[10]。核糖體合成調(diào)控因子1(RRS1)主要定位于細(xì)胞核仁和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，參與調(diào)節(jié)核糖體蛋白、RNA生物合成[11]，并且與細(xì)胞的衰老[12]、周期調(diào)控[13]等密切相關(guān)。近年來(lái)研究表明，在多種不同的腫瘤中都觀察到RRS1的表達(dá)明顯升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，沉默RRS1的表達(dá)可明顯促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡[14]。因此RRS1可作為治療乳腺癌的一個(gè)潛在的新靶標(biāo)，但目前尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于RRS1與化療藥耐藥性之間關(guān)系的研究報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)擬探討沉默RRS1表達(dá)是否會(huì)增強(qiáng)乳腺癌耐藥細(xì)胞對(duì)于阿霉素的敏感性，為乳腺癌耐藥研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料和方法

1.1 材料來(lái)源

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系由我院醫(yī)學(xué)研究中心贈(zèng)送；人耐阿霉素乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞系購(gòu)自湖南豐暉生物科技有限公司；DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Cell Counting Kit-8(CCK8)試劑盒、胰蛋白酶消化液及青鏈霉素混合液、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；RRS1單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；慢病毒轉(zhuǎn)染載體和轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)于上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

將MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)0.10的胎牛血清和含10 g/L青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中；MCF-7/ADR細(xì)胞培養(yǎng)于含5 mg/L阿霉素、含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清和含10 g/L青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中。所有細(xì)胞均置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1Western blot方法檢測(cè)RRS1在MCF-7與MCF-7/ADR細(xì)胞中的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌MCF-7細(xì)胞與耐阿霉素乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞分別進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度約達(dá)90%時(shí)，棄掉培養(yǎng)基，分別用PBS洗1次，采用RIPA裂解法提取總蛋白，裂解緩沖液配制比例為PMSF∶RIPA=1∶100，采用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。以SDS-PAGE電泳分離蛋白，目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后，室溫下以體積分?jǐn)?shù)0.05脫脂奶粉封膜2 h，然后在4 ℃下以一抗(1∶1 000)孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次后，二抗(1∶1 000)室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，使用ECL試劑盒檢測(cè)蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.3.2慢病毒的構(gòu)建及各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 慢病毒構(gòu)建委托上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)分為攜帶有shRRS1慢病毒感染組(實(shí)驗(yàn)組)和空載體慢病毒轉(zhuǎn)染組(對(duì)照組)兩組。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，得出實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的MOI值均為30，最適作用時(shí)間為9 h。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7/ADR細(xì)胞用胰酶消化后進(jìn)行計(jì)數(shù)，以每孔6×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度約達(dá)60%時(shí)換為無(wú)血清培養(yǎng)基，加入病毒及感染增強(qiáng)液，作用9 h換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(GFP)的強(qiáng)弱，即代表病毒的轉(zhuǎn)染效率的高低。選取GFP表達(dá)率70%以上穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3Western blot方法檢測(cè)MCF-7/ADR細(xì)胞RRS1蛋白的表達(dá)量 提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞總蛋白，以Western blot方法檢測(cè)兩組細(xì)胞中RRS1蛋白的表達(dá)量。

1.3.4CCK8法檢測(cè)阿霉素對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞的抑制水平 取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，以3 000個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，后分別加入0.01、0.10、0.20、0.30、0.50、0.80、1.00 mg/L的阿霉素37 ℃培養(yǎng)48 h，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每孔細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌2次后，加入10 μL CCK8，正常培養(yǎng)條件下孵育3 h，用酶標(biāo)儀測(cè)量波長(zhǎng)450 nm處的吸光度值，計(jì)算IC50值。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)阿霉素累積量 取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞分別與阿霉素(5 mg/L)共同孵育2 h后用胰酶消化，離心重懸于冰冷的PBS中，由于阿霉素自帶紅色熒光，可通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)紅色熒光強(qiáng)弱，以紅色熒光強(qiáng)弱代表細(xì)胞內(nèi)阿霉素的相對(duì)累積量。

1.3.6平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖水平 制備穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組單細(xì)胞懸液，將兩組細(xì)胞以3 000個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔。置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，約10～14 d出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的集落后終止培養(yǎng)。棄舊培養(yǎng)基加PBS后洗3次。每孔加體積分?jǐn)?shù)0.04多聚甲醛溶液2 mL固定細(xì)胞30 min；結(jié)晶紫染色30 min，流水緩慢沖洗，室溫自然晾干；將6孔板倒置并疊加一張帶有網(wǎng)格的透明膠片，低倍鏡下觀察集落形成情況，計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.3.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 制備穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組單細(xì)胞懸液并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取5×105～1×106個(gè)細(xì)胞重懸于500～1 000 μL 1×Binding Buffer中，2 000 r/min離心5 min；棄上清液，加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞后，加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻，室溫避光孵育15～20 min；加入200～300 μL 1×Binding Buf-fer，上機(jī)檢測(cè)前5 min加入5 μL PI，混勻后將細(xì)胞懸液用300目篩網(wǎng)過(guò)濾，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 6.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞中RRS1表達(dá)量比較

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞中RRS1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.79±0.03和1.27±0.02，兩者比較差異均具有顯著意義(t=13.05，P<0.05)。

2.2 兩組細(xì)胞中RRS1蛋白表達(dá)量的比較

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中RRS1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.38±0.07、0.33±0.04，組間比較差異具有顯著性(t=12.71，P<0.05)。

2.3 阿霉素對(duì)兩組MCF-7/ADR細(xì)胞抑制能力的比較

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組阿霉素對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞IC50值分別為(0.74±0.12)、(12.37±0.07)mg/L，兩組比較差異有顯著性(t=2.87，P<0.05)。

2.4 兩組細(xì)胞中阿霉素累積量的比較

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中阿霉素的累積量分別為(5.84±0.11)%、(24.46±1.10)%，兩組比較差異有顯著性(t=16.92，P<0.05)。

2.5 兩組的細(xì)胞增殖能力比較

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的克隆形成數(shù)分別為430.0±5.8、177.3±1.5，兩組比較差異均具有顯著意義(t=42.44，P<0.05)。

2.6 兩組的細(xì)胞凋亡率比較

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率分別為1.26±0.03、65.34±0.52，兩組比較差異具有顯著意義(t=122.40，P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 兩組細(xì)胞凋亡率比較

3 討 論

目前，乳腺癌已經(jīng)超過(guò)肺癌成為全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1]，而且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。化療是乳腺癌綜合治療的重要組成部分，化療藥物對(duì)乳腺癌有明顯的療效，可以明顯改善乳腺癌患者的預(yù)后[15-16]。阿霉素作為一種蒽環(huán)類(lèi)廣譜化療藥物，較早應(yīng)用于乳腺癌的治療，在乳腺癌術(shù)后輔助治療、新輔助治療和轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)后的再次治療中被普遍采用[17]。單獨(dú)應(yīng)用阿霉素或阿霉素與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)早、晚期乳腺癌均療效顯著。但部分患者在接受阿霉素化療一段時(shí)間后，會(huì)出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥；還有部分未接受過(guò)阿霉素化療的患者對(duì)該藥物的反應(yīng)性很低，會(huì)出現(xiàn)原發(fā)性耐藥，但具體的耐藥機(jī)制尚不清楚[18-19]。因此揭示乳腺癌對(duì)阿霉素耐藥的機(jī)制，尋找耐藥相關(guān)分子或基因，對(duì)提高阿霉素療效具有重要意義。

目前研究發(fā)現(xiàn)，化療耐藥性的產(chǎn)生與某些基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的異常表達(dá)密切相關(guān)[10]。RRS1作為RRS的一種，主要參與核糖體的生物合成過(guò)程[11]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，RRS1的表達(dá)水平與宮頸癌的細(xì)胞周期有關(guān)[20]。在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織和細(xì)胞中RRS1均表達(dá)升高，促進(jìn)了視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。WU等[21]研究發(fā)現(xiàn)，干擾RRS1可抑制大腸癌細(xì)胞周期的G2/M進(jìn)程，對(duì)新生血管生成也有抑制作用，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。目前已經(jīng)證實(shí)RRS1在乳腺癌組織中的表達(dá)水平高于周?chē)姆前┙M織，且RRS1的高表達(dá)水平與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良臨床預(yù)后有關(guān)。體內(nèi)外研究均顯示，沉默RRS1基因能抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖[14]，并顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡。以上研究均證實(shí)RRS1表達(dá)升高會(huì)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但RRS1的表達(dá)水平變化是否與乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素抗性的產(chǎn)生有關(guān)尚不清楚，在乳腺癌細(xì)胞阿霉素抗性中的作用機(jī)制也不是很明確。

本研究首先比較人乳腺癌MCF-7細(xì)胞和人耐阿霉素乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞中RRS1的表達(dá)水平，顯示與MCF-7細(xì)胞相比，RRS1在MCF-7/ADR細(xì)胞中呈高表達(dá)，說(shuō)明RRS1在耐阿霉素的乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)水平較高。為進(jìn)一步探討相關(guān)的作用機(jī)制，本研究通過(guò)慢病毒載體介導(dǎo)的shRNA沉默MCF-7/ADR細(xì)胞中RRS1的表達(dá)，檢測(cè)阿霉素對(duì)細(xì)胞IC50值的變化，結(jié)果顯示在MCF-7/ADR細(xì)胞中沉默RRS1后可使阿霉素對(duì)細(xì)胞的IC50值明顯降低，因此提示RRS1的表達(dá)升高與阿霉素抗性的產(chǎn)生有關(guān)。流式細(xì)胞術(shù)及平板克隆方法檢測(cè)顯示，沉默RRS1后，可顯著促進(jìn)MCF-7/ADR細(xì)胞凋亡，抑制MCF-7/ADR細(xì)胞的增殖能力，并使細(xì)胞內(nèi)阿霉素累積量明顯升高，表明RRS1表達(dá)升高可能會(huì)導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素產(chǎn)生抗性，而沉默RRS1表達(dá)后可降低乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的抗性。

綜上所述，RRS1在耐阿霉素乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞中高表達(dá)，沉默RRS1表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素的抗性，RRS1在乳腺癌細(xì)胞阿霉素抗性的產(chǎn)生過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，有望成為乳腺癌治療新的分子靶點(diǎn)。